细胞色素C的提取

实验一、细胞色素C的制备和测定

摘要：细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，包括多种能够传递电子的含铁蛋

白质。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体。细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。在自然界中，细胞色素C存在于一切生物细胞里，其含量与组织的活动强度成正比。本实验以新鲜牛心为材料提取、制备和纯化细胞色素C，得到其粗品溶液，并进行含量测定。

关键词：细胞色素C 提取 制备 纯化 含量测定 1、原理：

细胞色素C包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C（cytochrome c，CytC）只是细胞色素的一种。它在呼吸链上位于细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶之间。线粒体中的细胞色素绝大部分与内膜紧密结合，仅有细胞色素C结合轻松，较易被分离纯化。

细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，每个细胞色素C分子含有一个血红素和一条多肽链。分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量较高，等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。它易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化性和还原性，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热，酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。

细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。在自然界中，细胞色素C存在于一切生物细胞里，其含量与组织的活动强度成正比。本实验以新鲜猪心为材料提取制备和纯化细胞色素C，得到其粗品溶液，方法简单易操作。

2 试验材料和方法

2.1 材料：

新鲜（冷冻）猪心样品。 2.2 试剂

① 1mol/L H2SO4 （55.5mL/L）：500mL ② 1mol/L NH4OH（67.6mL/L）：500mL ③ 12oCl2：250mL ④ 25%(NH4)2SO4：500mL ⑤ 0.2% NaCl：500mL

⑥ 20% 三氯乙酸（TCA）：100mL ⑦ 人造沸石：白色颗粒， 40-60目 ⑧ 联二亚硫酸钠

⑨ 细胞色素C标准液（3mg/ml） 2.3 仪器：

① 绞肉机 ②电磁搅拌器 ③离心机 ④分光光度计 ⑤透析袋等 2.4 实验方法： 2.4.1 材料处理

新鲜或冷冻猪心，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小快，放入绞肉机中绞碎（两遍）。 2.4.2 细胞色素C粗品制备 2.4.2.1 提取：

称取猪心碎肉200克，加自来水300毫升酸化水（水预先用6~8毫升，1mol/L的硫酸酸化）。用电磁搅拌器搅拌提取，再用1mol/L的硫酸调PH=4.0（需要不断调整），搅拌提取1.5小时。用1mol/L的氨水调PH=6.0，停止搅拌。四层纱布挤压过滤，收集滤液。 2.4.2.2 中和：

用1mol/L的氨水调滤液PH=7.2-7.5，利用等电点沉淀杂蛋白，静置20~30分钟，使沉淀沉下。虹吸上部清夜，过滤除杂质，下部浑浊液离心（3000rpm,15min）。合并得到的红色清夜，测量体积。 2.4.2.3 吸附：

每人称取人造沸石4g，加水搅拌，除去12s内不下沉的细颗粒。向柱内加去离子水至1/2体积，然后边搅拌边连续、均匀地将预处理好的人造沸石水溶液装填入柱，避免柱内出现气泡。装柱完毕，打开柱下端夹子，使柱内沸石面上剩下一薄层水。

将中和好的澄清滤液小心加到沸石上面，勿冲动沸石，使之流入柱内进行吸附，控制流出液的速度不超过10ml/min。随着细胞色素C被吸附，人造沸石由白色变为红色，流出液应为淡黄色或微红色。 2.4.2.4 洗脱

吸附完毕，可在柱内洗涤：依次用30ml自来水、去离子水、0.2%氯化钠溶液、去离子水洗柱。然后用25%硫酸铵溶液洗脱（流速小于2ml/min），收集红色洗脱液（洗脱液一旦变白，立即停止收集），测量体积（控制在15ml左右）。洗脱完毕，人造沸石回收，可再生使用。 2.4.2.5 盐析

为了进一步提纯细胞色素C，向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使硫酸铵溶液浓度为45%（约相当于67%的饱和度，即100ml洗脱液加17g硫酸铵），放置过夜，杂蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的细胞色素C滤液，测量体积。 2.4.2.6 TCA 沉淀

按8%体积滴加20%TCA，边加边搅拌。此时细胞色素带正电荷，与其结合生成可逆沉淀析出，立即离心（3000rpm，15min）,收集沉淀（若上清液仍为红色，倒出后再补加5%体积的TCA，再次离心，收集沉淀）。沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过10mL）。 2.4.2.7透析

溶解液装入透析袋对自来水（30min）、去离子水（10~20min）透析（用磁力搅拌器搅拌），用BaCL2 检测袋周围水的SO4（用试管收集流下来的

2?透析液约1ml，滴加1-2滴BaCL2试剂至试管中。摇匀若无白色沉淀，表示透析完全）。过滤除去不溶物质，得到细胞色素C的粗品液，量体积，测定其含量。

3 结果与分析

以细胞色素C的浓度（mg/ml）为横坐标，以吸光度A520nm为纵坐标制作标准曲线，按表1绘制细胞色素C含量的标准曲线(图1)，从标准曲线上按公式：

计算出样品液中细胞色素C的质量（mg）。 试管编号 标准溶液（ml） 蒸馏水（ml） 还原粉（联二亚硫酸钠） A520nm 0.00 0.15 1 0 4 2 0.2 3.8 3 0.4 3.6 4 0.6 3.4 5 0.8 3.2 6 1.0 3.0 7（样品液) (ml） 8 0 少许（约3mg） 0.30 0.45 0.60 0.75 0.115 图1 细胞色素C标准曲线

标准曲线0.7000.6000.5000.4000.3000.2000.1000.0000.000.10y = 0.8284x + 0.0035R = 0.99792吸光度0.200.300.40浓度0.500.600.700.80C

C色素= =0.1346（mg/ml）

注意事项：

(1) 酸水提取时，由于组织液的释出使pH上升，因此需不断调整pH直至稳定在pH3.5-4.0。

(2) 为使细胞色素C充分被沸石柱吸附，吸附时流速应该慢些。洗脱时同样控制流速慢些，使细胞色素C在比较少体积内被充分洗脱出来。

(3) 盐析时需加入粉末状硫酸铵，并且边加边搅拌，切忌一下子到进去，造成局部浓度过大使细胞色素C被盐析。

(4) 三氯乙酸是一种蛋白变性剂，可使蛋白质变性沉淀。要通过控制三氯乙酸的浓度和作用时间，使其产生的是可逆沉淀，达到进一步纯化作用。因此必须要逐滴加入三氯乙酸，搅匀后尽快离心，避免局部酸浓度过大和接触时间过长，产生细胞色素C不可逆变性沉淀造成损失。

(5) 透析脱盐是利用细胞色素C分子较大，不能通过一定截留值的半透膜，而其中的盐分由于分子较小，浓度很高，容易透过半透膜从高浓度向低浓度的水相移动，达到去除效果。并且在透析前一定要检查透析袋有无渗漏。

(6) 为尽量减少损失，在每个操作过程都要细心，例如过滤用的纱布、滤纸事前一定要用少量水润湿。

(7) 加入过多还原粉（联二亚硫酸钠）会使测定溶液迅速变混浊而无法比色，因此加入量应严格控制，并迅速比色。

4 思考题

1、试以细胞色素C的制备为例，总结出蛋白质制备（分离纯化）的主要方法，并简述其原理。 答：（1）透析和超滤：利用大分子不能透过半透膜，而小分子可以穿过半透膜，从而达到分离纯化的目的；（2）等电点沉淀：利用蛋白质在其等电点的溶解度最小，且不同蛋白质的等电点不相同，从而达到分离纯化的目的；（3）盐析：利用蛋白质在盐溶液中可产生可逆沉淀而达到分离纯化的目的；（4）有机溶剂沉淀（5）电泳（6）亲和色谱

2、本实验应用了哪些基本的生化分离纯化的方法？ 答：（1）透析；（2）等电点沉淀；（3）盐析；（4）层析 3、有哪些方法可以进行蛋白质脱盐处理？ 答：（1）透析；（2）凝胶过滤

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