牡丹花色与花色苷

摘 要

论文题目：牡丹花色与花色苷的研究

摘 要

牡丹为我国著名花卉，被称为“万花一品”、“冠绝群芳”的“花王”。花色是牡丹重要的观赏性状，花色素则是牡丹花色形成的物质基础，又因多种生理活性而具有潜在的应用价值。本文主要研究了中原牡丹品种群的花色、花色苷及二者的相关性，确定了大孔吸附树脂法纯化牡丹花色苷的工艺条件，测定了牡丹花提取液与花色苷的抗氧化活性。具体研究内容及结果如下：

1．利用色差仪按国际照明委员会（International Commission on Illumination，CIE）表色系统对94个中原牡丹品种的花色进行测定，并在此基础上，通过CLUSTER过程将花色三刺激值（明度L*、 色相a* 和b*）采用Ward离差平方和法进行了聚类分析。结果表明：94个中原牡丹品种花色在CIE表色系统坐标系上的分布广泛，聚类分析将其分为9个色系：白（20种）、绿（1种）、浅粉（8种）、粉红（13种）、粉蓝（12种）、红（14种）、紫（11种）、红紫（7种）、红黑（8种），不同色系牡丹的L*、 a* 和b*值特征明显。白、浅粉、粉红和红色系以及粉蓝、紫和红紫色系的L*与a*、L*与彩度（C*）均表现出显著的负相关性（L*与a*的相关系数R2分别为0.9703和0.6067，L*与C*的相关系数R2分别为0.8519和0.714）；多数色系牡丹（除红和红黑外）的L*与b*呈显著的正相关关系（R2为0.8653）。

2．采用高效液相色谱与二极管陈列检测器和电喷雾电离质谱联用技术（HPLC-DAD-ESI-MS）分析了48个品种的中原牡丹花瓣中的花色苷总含量、种类以及各花色苷单体的相对丰度。结果表明：中原牡丹花中共含有基于天竺葵色素、芍药色素和矢车菊色素的五种花色苷，分别为矢车菊色素-3, 5-O-二葡萄糖苷（Cy3G5G），矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷（Cy3G）、芍药色素-3, 5-O-二葡萄糖苷（Pn3G5G）、芍药色素-3-O-葡萄糖苷（Pn3G）和天竺葵色素-3, 5-O-二葡萄糖苷（Pg3G5G），不含天竺葵色素-3-O-葡萄糖苷（Pg3G）。48个品种中原牡丹花色苷总含量变化范围为0~289.5mg/100g；不同色系牡丹花色苷单体的相对丰度差异显著，粉红和红色系品种以天竺葵色素-3, 5- O-二葡萄糖苷为主（相对丰度分别为88.09％和 79.06%），不含或含有近少量Pn类色素，属于PgPn类；粉蓝、紫和红黑、红紫色系以芍药色素-3, 5- O-二葡萄糖苷为主（相对丰度分别为88.35％、82.19％和 75.65％、72.74%），矢车菊类色素在红紫和红黑色系牡丹中的相对丰度较大，属于PnCy类。通过分析牡丹花色与花色苷关系可

I

摘要

知，亮度值L*与花色苷总量(TA)有显著负相关性，在PnCy类中a*和b*都与TA没有相关性，而PnPg类a*与TA正相关，b*与TA没有相关性。

3．研究比较了多种大孔吸附树脂的静态吸附特性，筛选出了适宜牡丹花色苷纯化的树脂，并确定了固定床吸附和解吸的工艺参数。结果表明：南开化工D-101、天津大钧D-401和安徽三星D-1300三种树脂的吸附率和解析率较高。三种树脂的吸附动力学行为符合二级吸附速率方程，吸附等温线可用Langmuir等温吸附方程描述。在相同条件下，D-1300树脂的吸附量高于另外两种，因此选择安徽三星D-1300树脂作为牡丹花色苷纯化的树脂。花色苷在D-1300树脂上的穿透曲线实验数据可用Bohart-Adams模型方程拟合，拟合公式可用于给定操作条件下花色苷穿透时间的计算。牡丹花色苷提取液经过D-1300树脂动态吸附分离的适宜上样浓度为0.141mg·mL-1 ，上样流速为2BV·h-1；洗脱溶剂为60%乙醇，洗脱流速为2BV·h-1。上述操作条件下，花色苷纯度可由0.31％提高到了20.05％。

4．测定了48个品种牡丹花瓣提取液的DPPH·清除活性和还原力，研究了‘洛阳红’品种的花色苷部分纯化样品清除DPPH·活性和还原力，并采用SDS-聚丙烯胺凝胶电泳法研究了其对牛血清白蛋白氧化损伤的抑制作用。结果表明：不同品种中原牡丹花色苷提取液的DPPH·清除率和还原力差异显著，分别为8.45~33.46、19.73~74.86 mg Vc/100g 花瓣鲜重，且DPPH·清除率和还原力之间具有良好的线性相关关系（R2=0.9387）。‘洛阳红’部分纯化的花色苷样品对DPPH·的清除活性高于芦丁，低于抗坏血酸，半清除浓度为96.28 μg·mL-1；其还原力强于芦丁，与抗坏血酸接近。0.1~500μg·mL-1花色苷样品对牛血清白蛋白（BSA）的氧化损伤具有一定抑制作用，量效关系明显。高浓度抗坏血酸和芦丁对牛血清白蛋白氧化有一定的促进作用。

关 键 词：牡丹，花色，花色苷，大孔吸附树脂，抗氧化，蛋白质损伤 论文类型：基础研究

II

目录

Subject: The study on flower colors and anthocyanins of tree peony

ABSTRACT

Tree peony is well-known in China, be named as “Wan Hua Yi Pin”and enjoy the honor of “The King of Flowers”. Flower color is one of the most important ornamental characters of tree peony . Anthocyanidins is material basis of forming flower colors of tree peony and have potential practical values bacause of many physiological activeties. The flower colors, anthocyanins, the relationship between them of Zhongyuan tree peony cultivar-groups were studied.The optimum conditions of the purification of anthocyanins from tree poney flowers were determined by the method of macroporous adsorbtion resins and the antioxidant activity of extract and anthocyanins from tree peony flower were assayed. The results were as follows:

1.The flower colors of 94 cultivars of Zhongyuan tree peony were measured by a NF333 spectrophotometer based on the International Commission on Illumination(CIE) color system. CIE color system L*, a* and b* were cluster analysed by CLUSTER process using Ward square sum of deviations. The results indicated that Zhongyuan tree peony was classified into nine color series ,such as , white(20), green(1), pale red and blue(8), pale red(13), pale blue(12), red(14), purple(11), reddish purple(7) and reddish black(8). And it showed the features of the values of L*, a* and b* of different color tree peony. The relationship between L* and a*, and L* and C* were showed obviously negative correlation of white, light pink, pale red, red and pale blue, purple , reddish purple tree peony ( the correlation coefficient between L* and a* were 0.9703 and 0.6067, L* and C* were 0.8519 and 0.714). Most flower color tree peony( except red and reddish black) had notebility positive correlation between L* and b* (R2 0.8653).

2. The total content and varieties of anthocyanins and the relative abundance of anthocyanin monomers in the petals of 48 cultivars of Zhongyuan tree peony were analysed by HPLC-DAD-ESI-MS. Five anthocyanins extracted from Zhongyuan tree peony were respectively cyanidin-3,5-di-O-glucoside(Cy3G5G), cyanidin-3-O-glucoside(Cy3G5G), glucoside(Pn3G)

and

peonidin-3,5-di-O-glucoside(Pn3G5G), pelargonidin-3,5-di-O-glucoside(Pg3G5G),

peonidin-3-O-except

for

pelargonidin-3-O-glucoside(Pg3G). The variation range of total content of anthocyanins in 48 cultivars tree peony was 0~289.5mg/100g. The diversity of relative

III

目录

abundance of anthocyanin monomers in different color tree peony was obvious, and the major anthocyanins in pale red and red cultivars were Pg3G5G (respectively, 88.09 and 79.06%), belongs to PgPn and in pale blue, purple, reddish purple and reddish black cultivars Pn3G5G was major (respectively, 88.35、82.19 and 75.65、72.74%), belongs to PnCy. The relative abundance of cyanidin was bigger in reddish purple and reddish black cultivars. The relationship between flower colors and anthocyanins of tree peony was analysed, which indicated that the bright value(L*) and total anthocyanins(TA) had obviously negative correlation, and no correletion in PnCy type between a* and TA, or b* and TA but in PnPg tree peony between a* and TA displayed positive correlation, and no relation between b* and TA.

3. The static adsorption characters of a variety of macroporous adsorption resins were studied, a resin fitted to purify peony anthocyanins was selected and the process parameters of Fixed-bed adsorption and desorption were determined. The results indicated that the adsorptive capacity and the rate of desorption of 3 resins D-101, D-401 and D-1300 were higher than others. The adsorption kinetics behavior was accord with the secondary adsorption rate equation and the adsorption isotherm curves could be described by Langmuir equation of the three macroporous resins. D-1300 was chosen to purify peony anthocyanin because at the same conditions the saturated adsorption amount was higher than other 2 resins. The breakthrough curve experiment data of D-1300 on anthocyanin was fitted by the Bohart-Adams equation, and the fitted formula can calculate breakthrough time of anthocyanins in given conditions. The optimum conditions of dynamic adsorption by D-1300 were as follows: the sample concentration, 0.141mg·mL-1; flow velocity, 2BV·h-1; eluent solvent, 60% ethanol; eluent velocity, 2BV·h-1. The purity of anthocyanins was increased from 0.31% to 20.05% at the conditions mentioned above.

4. Anthocyanins from 48 cultivars of tree penoy flowers were extracted with methanol. Antioxidant activities were determined by the ferric reducing antioxidant power (FRAP) and 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH·) methods. The results showed all clutivar extracts exhibited different DDPH· scavenging capacity and the reducing power, however, varying within a wide range, respectively 8.45~33.46、19.73~74.86 mg Vc/100g Petal fresh weight. Reducing power was highly correlated with DDPH· scavenging capacity (R2=0.9396). Antioxidant activities of partial puried ?Luo Yang Hong? anthocyanin (LYHA) were further evaluated. It is found that DDPH· scavenging capacity of LYHA (IC50=96.28 μg·mL-1) was higher than rutin and significantly lower than ascorbic acid, while its reduing power was much greater than

IV

目录

rutin and equal to ascorbic acid. Also, LYHA at 0.1~500μg·mL-1 inhibited oxidative damage of Bovine Serum Albumin(BSA) induced by hydroxy radical in a concentration-dependent manner. However, rutin and ascorbic acid showed prooxidant activity towards BSA at high concentrations.

KEY WORDS: tree peony,flower colors, anthocyanin, macroporous adsorption resin,

antioxidantion, protein damage

Dissertation Type: basic research

V

目录

目 录

第1章 绪论 ................................................ 1

1.1 植物花色的研究 ....................................................................................................... 1 1.2植物花色苷的研究 .................................................................................................... 1 1.2.1花色苷的结构与理化性质 ................................................................................. 1 1.2.2 花色苷的提取、纯化、结构鉴定和含量测定 ............................................... 3 1.2.3 花色苷的生理功能 ............................................................................................ 8 1.3 牡丹花色与花色苷的研究 ....................................................................................... 9 1.4 主要的研究内容、目的和意义 ............................................................................. 10

第2章 牡丹花色测定及其表型分析 ........................... 11

2.1 引言 .......................................................................................................................... 11 2.2 实验材料与方法 ..................................................................................................... 11 2.2.1 实验材料 .......................................................................................................... 11 2.2.2 牡丹花色的测定 .............................................................................................. 12 2.2.3 数据分析 .......................................................................................................... 12 2.3 结果与分析 ............................................................................................................. 12 2.3.1 中原牡丹品种花色的测定 .............................................................................. 12 2.3.2 中原牡丹品种花色的聚类分析 ...................................................................... 12 2.3.3 中原牡丹品种花色三刺激值之间的关系 ..................................................... 17 2.4 结论 .......................................................................................................................... 19

第3章 牡丹花色苷的种类与含量 ............................. 20

3.1 引言 .......................................................................................................................... 20 3.2 材料与方法 ............................................................................................................. 20 3.2.1 材料、仪器与试剂 .......................................................................................... 20 3.2.2 实验方法 .......................................................................................................... 21 3.2.3 数据分析 .......................................................................................................... 21 3.3 结果与分析 ............................................................................................................. 21 3.3.1不同色系中原牡丹花色苷总含量和组成分析 .............................................. 21 3.3.2 牡丹花色三刺激值与花色苷测定值的相关性分析 ..................................... 26 3.4 结论 .......................................................................................................................... 28

第4章 大孔吸附树脂法纯化牡丹花色苷工艺研究 ............... 30

VI

目录

4.1 引言 .......................................................................................................................... 30 4.2 材料与方法 ............................................................................................................. 30 4.2.1 实验试剂和仪器 .............................................................................................. 30 4.2.2 实验方法 .......................................................................................................... 30 4.3 结果与讨论 ............................................................................................................. 34 4.3.1 树脂静态吸附实验结果 .................................................................................. 34 4.3.2 大孔吸附树脂D-1300动态吸附和解吸实验结果 ....................................... 42 4.4 结论 .......................................................................................................................... 45

第5章 牡丹花色苷的抗氧化活性研究 ......................... 46

5.1 引言 .......................................................................................................................... 46 5.2 材料与方法 ............................................................................................................. 46 5.2.1 实验材料 .......................................................................................................... 46 5.2.2 主要仪器和试剂 .............................................................................................. 46 5.2.3 实验方法 .......................................................................................................... 47 5.2.4 数据处理 .......................................................................................................... 48 5.3 结果与讨论 ............................................................................................................. 48 5.3.1 不同品种牡丹花色苷提取液的DPPH·清除活性和还原力 ......................... 48 5.3.2 ?洛阳红?花色苷的抗氧化作用 ........................................................................ 51 5.4 结论 .......................................................................................................................... 54

第6章 结论 ............................................... 55 参考文献 .................................................. 57 致 谢 ................................... 错误！未定义书签。 攻读硕士学位期间的研究成果 ................. 错误！未定义书签。

VII

第1章 绪论

第1章 绪论

1.1 植物花色的研究

花色(flower color)，就是指显花植物的整个生殖器官的颜色[1]。是影响花卉最主要的观赏性状之一。花色的产生是经过授粉者亿万年长期选择的结果，是植物不断进化的表现[2]。

影响植物花色表现的有内在因素和外在因素。大自然呈现出的每一种颜色都是多种因素共同作用的结果。根据先前科研工作者大量的研究知道，首先花色与花瓣中所含的色素种类、含量、分布以及花瓣细胞的结构有着密切的关系。这些色素的种类非常多，可以分为类胡箩卜素、类黄酮和生物碱三大类[2]。类胡萝卜素是胡萝卜素和胡萝卜醇的总称，都是呈现黄色、橙色或红色的色素。一般不溶于水，可溶于脂肪或类脂。其以沉积或结晶状态存在于细胞质内的色素体上。而类黄酮是化学结构上以2－苯基色酮核为基础的一类物质的总称。类黄酮中除花色素苷是红色系以外，其它均属黄色系。类黄酮中的查耳酮、橙酮是深黄色，其他为淡黄色或近于无色。以溶解于细胞液的状态存在于液泡内。花色素是类黄酮的一种，是从红色到紫色、蓝色的花色母体的色素，也是对花瓣花色影响较大的一种色素[1]。

此外细胞液泡的pH、辅助着色物质、金属络合等内在因素也会显著影响花瓣的颜色。而外因则有温度、光照以及土壤水分条件等[2]。

总之，通过对牡丹花色的研究，可以为今后进一步丰富花色，提高牡丹的观赏价值提供一定的科学理论依据。

1.2植物花色苷的研究

1.2.1花色苷的结构与理化性质

花色苷（anthocyanin）是花色素（anthocyanidin）与糖，以糖苷键结合而成的一类化合物，广泛存在于植物的花、果实和叶中，使其呈现由红、紫红到蓝等不同颜色。现已查明，天然花色苷配基的基本结构为3, 5, 7－三羟基－2－苯基苯并吡喃[3]，结构式如图1－1：

由于苯环中取代基、羟基和甲氧基数量和位置不同，衍生出6中主要的花色素，分别是天竺葵色素（pelargonidin）、矢车菊色素（cyanidin）、飞燕草色

1

河南科技大学硕士学位论文

素（delphinidin）、芍药色素（peonidin）、牵牛花色素（petunidin）和锦葵色素（mavlvidin）。天竺葵色素呈现砖红色；矢车菊色素及芍药色素表现为紫红色；而飞燕草色素及锦葵色素表现为蓝紫色[4]。

花色苷类色素易溶于水、甲醇、乙醇等强极性容积，难溶于乙醚、丙酮、石油醚等非极性溶剂，属于非脂溶性色素。在0.01％盐酸的甲醇中，花色苷有两个最大的特征吸收区，可见区为520～560nm；紫外区在270～280nm处，如果花色苷存在酰基化，则在310～320nm处存在特征吸收峰。大多数花色苷颜色会随着pH值的变化而变化，在pH由低到高变化时，花色苷溶液呈现由红色到无色直至蓝色的变化，因此为了保持花色苷原有的色泽，其溶液应该保持酸性环境。而且花色苷在保存过程中应该保持低温。

图1-1 花色苷基本结构式 Fig. Basic structure of anthocyanins

化合物 天竺葵色素 矢车菊色素 飞燕草色素 芍药色素 牵牛花色素 锦葵色素

B环取代

R1 H OH OH OCH3 OCH3 OCH3

R2 H H OH H OH OCH3

表 1－1 6种主要的花色素

Table 1-1 Six major species of anthocyanidins

花色素由于与糖配基结合位置和种类的不同，能够形成多种的花色苷，其稳定性和颜色也会有所不同。与花色素结合最常见的糖是葡萄糖，还有鼠李糖、木

2

第1章 绪论

糖、半乳糖和阿拉伯糖等单糖；二糖有芸香糖、2-葡糖-β-葡糖苷、龙胆二糖与昆布二糖等；三糖有时也可与花色素结合。其中3位羟基上结合糖可为单糖、二糖或三糖，5位和7位结合的多为单糖。甲氧基化多在B环的3位和5位。多羟基存在使花色苷的稳定性不如多甲氧基高，其稳定性随着糖配基羟基化程度增加而下降，甲氧基化程度增加而上升[5]。

而被酰基化的花色苷稳定性会更高。与其发生酰化作用的有机酸主要为：肉桂酸、阿魏酸、p-香豆酸、咖啡酸等有机酸。 一般结合在花色素的3位糖上，或者在3位和5位糖上结合2个酸。

1.2.2 花色苷的提取、纯化、结构鉴定和含量测定

1. 花色苷的提取

(1) 溶剂萃取法：此法是国内提取花色苷最常用的方法。先用有机溶剂浸提，在经过过滤、减压浓缩、真空干燥精制等工艺得到最终产品。常用的提取溶剂有水、酸碱溶液，有机溶剂如乙醇、甲醇、丙酮、烷烯烃、苯等。丁九斤[6]等研究了醋酸溶液提取蓝莓花色苷，提取率可以达到92.8％。赵慧芳[7]等用1％HCl-甲醇提取黑莓果实花色苷，提取90min，能够达到很显著的效果。

(2) 超声波辅助萃取法（Ultrasonic-Assisted Extraction，UAE）：超声波是指频率为20千赫～50兆赫的电磁波，是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、扰动效应、高加速度、击碎和搅拌作用等多级效应。增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透率，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行。与常规的萃取技术相比，超声波萃取技术快速、价廉、高效[8]。孟凡丽等[9]比较了超声波法和热浸提法对越橘果实花色苷的提取，表明超声波法提取液颜色深，花色苷含量高，提取率也高。朱洪梅等[10]对超声波辅助提取紫甘薯花色苷的工艺进行了研究，确定最佳提取工艺为：提取温度70℃，提取时间40min，料液比1：10。M.Corrales等[11]比较了超声波法、高静水压技术（high hydrostatic pressure, HHP）和脉冲电场法（pulsed electric fields, PEF）提取葡萄花色苷，显示超声波法比一般方法效率高3倍。Fang Chen等[12]研究了超声波辅助法提取红木莓花色苷最优工艺条件，结果表明其料液比为1：4，提取时间200s，功率400W，提取率大概为78.13％。

(3) 微波辅助萃取法（Microwave-assisted extraction, MAE）：微波萃取是利用微波能来提高萃取效率的一种较新技术。微波是一种频率300～300000MHz的电磁波。在微波场中吸收微波能力的差异使得基本物质的某些区域或萃取系统中的某些组分被吸收加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进入到介

3

河南科技大学硕士学位论文

电常数较小、微波吸收能力相对较弱的萃取剂中。具有设备简单、适用范围广、重现性好、萃取效率高、萃取时间短、能耗低、污染小等特点[13]。

余红英等[14]研究了微波提取木棉花色素的工艺，微波功率为750W、辐射时间90s、固液比1：60(W/V)。Sun等[15]研究了利用微波辅助提取法提取红木莓花色苷的工艺，其料液比4：1(mL/g)，提取时间12min，功率366W。

(4) 酶法提取：酶法提取在食品工业中应用广泛，酶处理可使细胞壁发生不同程度改变，如软化、膨胀和崩溃等，从而提高细胞内含物提取率。如应用于果蔬榨汁、花粉饮料有利于细胞内物质渗出、增加出汁率约10％、减少压榨压力、促进汁液榨取和澄清作用[16]。李颖畅等[17]用纤维素酶、果胶酶及二者复合对蓝莓果中花色苷进行了提取，发现纤维素酶提取效果好。其酶用量5mg/g、料液比1g:8ml、pH5.0、提取时间60min、酶解温度45℃、提取2次，证明蓝莓果中花色苷含量约为350mg/100g鲜果。赵玉红等[18]用酶法和超声波法联用提取蓝靛果果渣中的花色苷，发现其比酶解法得率高5.12％，比超声波法高17.44％。B.B.Li.Smith等[19]研究了酶法辅助提取5种柑橘属果皮中多酚类物质，发现柚子果皮中多酚含量最高。

(5) 超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction, SFE）：是食品工业新兴的一项萃取分离技术。其原理是利用处于临界温度、临界压力之上的超临界流体具有溶解许多物质的性质，将其作为萃取剂，从液体或固体萃取分离出特定成分的新型分离技术[20]。近年，人们尝试将SFE技术应用于天然色素萃取。张树宝

[21]

研究了超临界CO2萃取大花葵花色苷的工艺，得出最佳萃取工艺参数：萃取

压力25Mpa、萃取温度60℃、萃取时间45min、物料比1：25时萃取率最高，为0.681％。Tünde Vatai等[24]使用超声波法提取了接骨木果和不同葡萄果渣中的多酚类化合物。

2. 花色苷的纯化

(1) 柱层析法（Column Chromatography,CC）：柱层析法又称为柱色谱法，是将待分离物质均匀地加在装有固定相的柱子中，再加入适当的溶剂冲洗，由于固定相和移动相相对各组分的亲和力不同，试样中各组分在两相中的分配不同，在柱中随流动相移动的速度不同，对固定相亲和力最弱的组分随洗脱剂首先流出，通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离[23]。目前大多采用凝胶、聚酰胺、硅胶、离子交换树脂、大孔树脂等[24]。

1 大孔吸附树脂法：大孔吸附树脂法是利用大孔吸附树脂对欲分离物质的○

吸附作用和筛选作用达到分离目的的方法。其以大孔树脂为固定相，是天然物提取液的有效成分有选择性的吸附在树脂上，而杂质部分不被吸附，在经适当的溶

4

第1章 绪论

液洗脱，收集有效成分的洗脱液，合并浓缩，回收溶剂，达到分离提取液中有效成分的目的。是分离天然产物化学成分如皂苷、生物碱、黄酮、香豆素及花色素的新工艺[23]。目前国内，有利用树脂法纯化紫玉米、蓝莓果、黑大豆、黑加仑果渣、黑米、荔枝果皮和血橙花色苷等研究[25-31]。Zhang等[32]用XAD-7树脂纯化荔子果皮花色苷，发现其对荔子花色苷的亲和力很高。Dietmar Kammerer等[33]同样用XAD-16 HP树脂纯化葡萄果渣提取物中的花色苷，可以达到96％-100％的总花色苷。

2 凝胶柱层析：凝胶柱层析也称排阻层析，工作原理是利用具有网状结构○

凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱的固定相多是交联的多聚糖（如葡聚糖或琼脂糖），小分子物质能进入其内部，洗脱下来的速度慢，而大分子物质却被排除在外部，洗脱下来的速度快，当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量分开了[24]。曹少谦等[31]对大孔树脂NKA-9分离的血橙花色苷再次用Toyopearl TSK-40S柱层析进一步纯化，得到了3个单一花色苷和1个混合花色苷。Zhang等[32]对树脂纯化的荔子果皮花色苷用交联葡聚糖LH-20柱层析法进行进一步的纯化，分离出来了4种花色苷。

3 聚酰胺层析法：聚酰胺是一类纤维树脂，分子链上的重复结构单元是酰○

胺基的聚合物。其原理是根据“氢键吸附”，即当所分离化合物的结构与聚酰胺形成氢键的能力越强时，其吸附也就越强，也就越难洗脱。此法在花色苷中应用不多，主要用于黄酮类化合物的分离纯化[24]。

4 硅胶层析法：硅胶层析法的原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得○

到分离，其中有微孔，对不同化合物的吸附能力不同，然后选用适当的洗脱剂进行洗脱从而达到分离目的[24]。唐克华等[34]研究表明以1.8％羧甲基纤维素钠（CMC）制备的硅胶G薄板最适宜红檵木花色素的层析分离，展层剂“水：乙醇：正丁醇：乙酸乙酯”的体积比为11:8:30:36时的分离效果最佳，共分离检测出7种水溶性花色素成分。

5 离子交换树脂法：离子交换树脂法依据的原理是物质的酸碱性、极性，○

也就是所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来

[24]

。胡隆基等[35]报道葡萄果汁和葡萄皮色素用磺酸型阳离子交换树脂进行纯(2) 膜分离法：膜分离法是用天然或人工合成的高分子膜，以外界能量或化

化，可除去浓缩液中的糖及有机酸，精制后的产品中色素的稳定性得到提高。 学位差为推动力，对混合物进行分离、分级、提纯和浓缩的方法，统称为膜分离

5

河南科技大学硕士学位论文

法[23]。花色苷提取中常用的膜分离技术有超滤(UF)、反渗透(RO)、电渗析(ED)等[24]。Barbara Gilewicz-Lukasik等[36]研究了纳米膜纯化野樱莓花色苷，发现亚硫酸钠不仅是好的提取剂而且提高了膜过滤的效率。

(3) 高速逆流色谱（High Speed Countercurrent Chromatography, HSCCC）技术是由美国国立健康研究院的Ito教授发明研制，是一种无固体载体的连续液体色谱技术。HSCCC利用单向流体动力学平衡原理，使2个互不相容的溶剂相在高速旋转的螺旋管中单向分布，其中一相作固定相，由恒流泵输送载有样品的流动相穿过固定相，利用样品在两相中分配系数的不同实现分离[3]。Degenhardt等

[37]

用装有3个螺旋管柱的CCC-100高速逆流色谱仪分离XAD-7纯化过的黑加仑

提取物，得到了4种花色苷。Du等[38]用一台柱容量364mL的高速逆流色谱仪分离了越橘中的花色苷，得到了飞燕草色素-3-O-β-d-葡萄糖-β-d-木糖苷和矢车菊色素-3-O-β-d-葡萄糖-β-d-木糖苷。

(4) 重结晶法：从非结晶状物质处理到结晶状物质，叫结晶。从比较不纯的结晶用结晶方法精制到较纯的结晶为重结晶[23]。向色素溶液中加入质量分数5％醋酸铅，使色素沉淀，再将沉淀用盐酸酸化的乙醇溶解形成氯化铅白色沉淀，过滤除去白色沉淀得到纯度较高的花色苷溶液。由于醋酸铅剧毒，所以此法不适用于食用天然色素的生产[24]。

3. 花色苷结构鉴定

花色苷种类很多，现在已经发现的就有400多种，而且每年都不断有新的发现。花色苷鉴定技术的发展对其结构、理化性质和生理功能的研究及其新资源的开发和指导生产有很大的意义。目前的鉴定方法主要有层析法、光谱法、质谱法、核磁共振、毛细管电泳及水解法等。

(1) 纸层析（Paper Chromatography, PC）：也称为纸色谱，是以纸为载体的液相色谱法。早在1944年由Martiu和Synge发现，当时主要用于分析氨基酸，目前多用于亲水化合物的分离[23]。根据花色苷在不同溶剂中的迁移值(Rf)和颜色来判断花色苷的类别。叶兴乾等[39]用层析法鉴定出了荸荠种杨梅果实中的花色苷为矢车菊花色苷苷元及其他5种微量苷元。

(2) 薄层层析（Thin-Layer Chromatography, TLC）：又称薄层色谱，1938年N.A.Izmailor和M.S.Schraiber首次在显微镜载玻片上涂布氧化铝薄层，用微量圆环技术分离了多种植物酊剂中的成分，形成了应用广泛的薄层色谱法[23]。原理与纸层析相同，也可采用与纸层析法相同的展开剂。杨朝霞[40]发现展层剂BAW效果最好，鉴定出了紫甘薯中3个组分的花色苷。

(3) 紫外-可见光谱法和红外吸收光谱法：紫外-可见光谱法很早就用于花色

6

第1章 绪论

苷的结构鉴定。色素的紫外吸收光谱是色素的重要特征。吸收光谱是鉴定和测量混合物中主要色素的最简单方法。其主要原理是依据花色苷的不同基团在不同波长下有不同的吸收峰，进而推断出其结构。而红外光谱目前在花色苷结构鉴定中的报道不多。花色苷的红外光谱主要有苯环、含氧杂环、糖和羟基及其甲氧基四部分[24]。

(4) HPLC、MS、HPLC-MS：高效液相色谱法（High Prformance Liquid Chromatography, HPLC）是在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成，对有机物进行分离分析的方法。主要特点：高压、高选择性、高灵敏度和高速[23]。Kammerer等[33]采用HPLC从葡萄果渣中鉴定出了14种花色苷。

质谱法（Mass Spectrometry, MS）是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种方法。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为不同，把离子按质荷比分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果[24]。杜琪珍等[41]用ESI-MS得到了2种主要花色苷单体的结构，其分别为：矢车菊色素-3-β-吡喃葡萄糖苷和飞燕草色素-3-葡萄糖苷。

HPLC-MS在花色苷鉴定中应用最广泛。Zhang等[32]用此法鉴定了荔枝果皮中的6种花色苷，主要是矢车菊色素-3-芸香糖苷。Sun等[12]利用HPLC-MS鉴定出红树莓中12种花色苷。

(5) 核磁共振法（Nuclear Magnetic Spectroscopy, NMR）：核磁共振法是有机结构鉴定的重要手段之一，广泛应用于天然产物的鉴定。Maurizio Fiorini[42]用NMR鉴定了草莓、接骨木果、茄子和萝卜中的花色苷。

(6) 毛细管区带电泳法（Capillary Zone Electrophoresis, CZE）：CZE是采用熔合二氧化硅毛细管，将分离溶剂调到一定pH值，花色苷在CZE中的迁移时间顺序取决于分子电荷和分子大小的比率，以及缓冲液复杂化合物的形式。因此，不同的花色苷接在覆盖有线性聚丙烯酰胺的毛细管壁上分离[24]。

4. 花色苷含量的测定

目前总花色苷的定量方法有很多，而花色苷单体多采用HPLC法。 (1) 单一PH值法：花色苷的最大吸收区在500～540nm范围内，在新鲜的植物提取液中在最大吸收区很少含有干扰物质，因此花色苷总量可以根据比尔定律通过适当的吸光值来测定。该方法需要在恒定的pH值介质中进行，一般用平均比消光系数（avE）来测定花色苷总量，误差小于0.2％[43]。陈炳华等[44]用该方法测定了吕宋荚迷果中花色苷的含量。

7

河南科技大学硕士学位论文

(2) pH示差法：该法依据之一是花色苷发色团的结构转换是pH值的函数，依据之二是起干扰作用的褐色降解物质的特性不随pH值而变化。通过实验确定两个对花色苷吸光度差别最大但是对花色苷稳定的pH值，根据公式可以计算出花色苷的总量[43]。杨兆艳[45]用pH示差法测定桑椹原汁中花色苷含量为0.02％。

(3) 差减法：就是先测定样品在可见光区的最大吸光度，经二氧化硫或亚硫酸盐漂白后，再测定一次吸光度，二者的差值就是花色苷的吸光度，参考用标准花色苷绘制的工作曲线，可将吸光度换算成浓度。此法的原理是基于花色苷可被二氧化硫或亚硫酸盐漂白，漂白后其在可见光的光谱特征消失，而干扰物质的吸光度却很少受二氧化硫或亚硫酸盐的影响。差减法因所使用的漂白剂也能降低某些干扰组分的吸光度而使总花色苷的实测浓度比理论浓度偏高，另外此法也不适合于C4位上有苯基或甲氧基的花色苷的定量分析[43]。

(4) 高效液相色谱法（HPLC0：HPLC不仅用于花色苷的定性，还可用于定量分析。其原理是基于花色苷的浓度与色谱图中的花色苷的峰面积成正比，因此可用于定量分析。目前，HPLC已被广泛的应用于水果、葡萄酒、果汁、花卉中总花色苷和单个花色苷的定量分析[43]。王贞强等[46]用HPLC法测定葡萄与葡萄酒中的花色素苷，在测得的9种花色苷中，均以锦葵色素-3-O-葡萄糖苷含量最高，分别占总成分的39.71％和69.55%。 1.2.3 花色苷的生理功能

(1) 抗氧化活性：细胞中的氧在转变成水之前，会产生许多活性氧（ROS）。正常情况下，生物体内活性氧的生成与清除处于动态平衡状态，当各种因素打破这一平衡而致活性氧浓度超过生理限度时，多余的氧自由基就会致使组织损伤，乃至诱发各种疾病和促使机体衰老。而各种抗氧化物质，可以将多余的活性氧自由基清除掉，从而保护细胞、组织免遭氧化伤害。Wang J等[47]采用了化学荧光发光法研究了紫甘薯花色苷对活性氧的清除作用，结果表明，紫色甘薯花色苷对·OH、H2O2等活性氧均有清除作用，尤其对·OH的清除能力强于抗坏血酸，且与浓度呈剂量关系。

(2) 抗癌活性：研究认为环境因素在癌症的发生和发展中发挥着重要的作用。因此完全可以通过外部环境的改变来降低肿瘤的发生率。正常细胞在接触各种致癌因素后，都会经过启动、促进和发展三个阶段才会转化为肿瘤细胞。在癌症形成的三个阶段中，都有高度活泼性的自由基参与。即致癌物必须在体内经活化而成的自由基攻击DNA才能致癌。因此各种抗氧化物在一定程度上都具有抑制肿瘤的功能。花色苷有比较强的抗氧化活性，因此也应该具备抗肿瘤活性，它

8

第1章 绪论

可以通过抑制肿瘤细胞的增殖、转移和诱导癌细胞的凋亡实现抗癌的目的。常徽等[48]对黑米花色苷的抗肿瘤活性研究结果显示，黑米花色苷可以明显影响HL-60细胞周期进程，100μg/ml的黑米花色苷作用24小时，可使S期细胞比例明显降低，G0/G1细胞比例明显升高，同时G2/M细胞也有所升高，但不显著。可见黑米花色苷可引起HL-60细胞阻滞于G0/G1期，从而抑制其增殖。

(3) 抗炎活性：环氧化物酶（COX）是催化花生四烯酸生成前列腺素G2（PGG2）和前列腺素H2（PGH2）限速酶。COX-2在正常生理条件下是不表达的，在许多促炎症和致突变因素的影响下，通过MAPK途径、核因子（NF-??）和AP-1途径等诱导COX-2的表达，COX-2通过多种机制影响细胞的增生凋亡、血管的生成、局部的侵润和免疫功能的抑制，参与病理过程。在众多花色苷中，具有邻二羟苯基结构的花色苷（花翠素、花青素）通过抑制MAPK途径中COX－2的表达阻止炎症的发生[49]。天然药理学认为多吃樱桃能减轻关节炎和疼痛[50]。Wang等[51]研究了从酸樱桃中分离得到的花色苷和它的糖苷配基矢车菊色素的抗炎作用，结果表明：矢车菊色素的抗炎活性强于阿斯匹林。

(4) 抗动脉粥样硬化：动脉粥样硬化（Atherosclerosis，As）是一种严重威胁人类健康的疾病。流行病学研究显示，血管内皮细胞的损伤是动脉粥样硬化发生的起始环节，而氧化性低密度脂蛋白（Oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL）的形成是造成血管内皮损伤，促进动脉粥样硬化发生发展的关键因素之一。花色苷可以增加细胞内超氧化物歧化酶和谷胱甘肽转换酶的活性而减少LDL的氧化进而抑制动脉粥样硬化的发生。余小平等[52]研究了黑米皮花色苷对动脉硬化斑块稳定性影响。发现实验中老鼠的血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C与对照组相比含量分别下降了37.13％、26.60％、47.21％和36.52％，小鼠As斑块中薄纤维帽和大脂核的频数分别降低了57.38％和53.13％，不稳定斑块的面积也有所下降。说明黑米皮花色苷能促进小鼠晚期斑块的稳定性。

此外，花色苷还具有抗菌，降血糖，抗衰老，抗皱作用等方面的作用。

1.3 牡丹花色与花色苷的研究

牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews）为我国著名花卉、花朵硕大、花容端丽、品种繁多，雍容华贵，被称为“万花一品”、“冠绝群芳”的“花王”。又名百两金、木芍药、富贵花、洛阳花等。唐代李正封有“国色朝酣酒，天香夜染衣“的诗句，又使“国色天香“成为牡丹的雅号。

牡丹原产于我国秦岭等地，为毛茛科、芍药属落叶性野生小灌木，在我国有一千五百余年的栽培历史[53]。中国现存牡丹8个种、2个变种、1个亚种、1个

9

河南科技大学硕士学位论文

变型，洛阳已发现的就有2个种，即紫斑牡丹和杨山牡丹。经过人工栽培后，出现了黑色、黄色、绿色、紫色和复色等，还出现了许多过渡性的花色。而今，洛阳牡丹的花色甚丰，有红、白、粉、黄、紫、蓝、绿、黑及复色等9大色系，五彩缤纷，万紫千红[54]。自古洛阳人爱花成俗。邵雍的“洛阳人惯见奇葩，桃李开花未当花，须是牡丹花盛发，满城方始乐无涯”的名诗，正是这种习俗的真实写照[53]。

洛阳牡丹具有广泛的应用价值，一是应用于观赏，二是药用，还可食用[2]。 自建国以来，尤其是牡丹被确定为中国的国花之后。国内对于牡丹的研究越来越多，也更加的深入。目前对于牡丹的研究主要集中在种质资源调查、区域分布、国内外的传播历史等以及开发牡丹根皮的药用价值，牡丹的育种及花期调控等方面的研究也较多。而对于牡丹花色以及牡丹花瓣中所含生物活性物质研究则相对较少。例如国内外对牡丹黄酮和花色素方面的研究则鲜见报到。王亮生等[55]的研究证实牡丹花中含有6种花色苷，其中中国地区的牡丹不含有天竺葵色素-3-O-葡萄糖苷（Pg3G）。而根据已有的对其他植物花色素与花色苷的研究知道，它们具有重要的生理活性作用，包括抗氧化、抗菌、抗癌、抗炎等多种作用。牡丹中所含花色苷种类和含量的多少也与牡丹五彩缤纷的颜色有很大的关系。

洛阳是中国牡丹的重要产地之一，具有丰富的牡丹资源。在每年花期过后都有大量的牡丹花资源白白的浪费掉，假如能够充分的利用这些资源，则对经济的发展有更好的促进作用。

1.4 主要的研究内容、目的和意义

本文按国际照明委员会（CIE）表色系统测定洛阳地区不同品种牡丹花的颜色，按照量化的标准通过聚类分析的方法根据颜色的不同对牡丹花进行分类，达到与传统分类方法相互补充，完善；利用盐酸酸化甲醇对新鲜牡丹花瓣浸提，然后利用高效液相色谱法（HPLC）测定不同品种牡丹花花瓣提取液中花色苷化合物种类和含量，结合花色测定的结果，研究牡丹花色与花色苷含量和种类的关系，为丰富牡丹花色提供科学的理论依据；对提取的牡丹花瓣提取液用大孔吸附树脂法进一步纯化，获得树脂纯化牡丹花色苷的最优工艺；研究树脂纯化后的牡丹花色苷对自由基的清除作用以及还原力的大小，对蛋白质损伤的保护作用。为今后综合开发洛阳地区的牡丹资源打下理论的基础。

10

第2章 牡丹花色测定及其表型分析

第2章 牡丹花色测定及其表型分析

2.1 引言

牡丹野生种花色单一，但经过漫长的自然选择以及人为因素的作用，花色逐渐丰富。隋朝时牡丹主要有红、白、黄色；唐朝时增加了紫色，同时白色中有浅白和白，红色有殷红和桃红；宋朝时增加了绿色和一花两色，红色和紫色都有了深浅之分，黄色出现了浅黄和深黄，白色中又有了洁白色；明朝时出现了过渡花色，如红色又分为大红、桃红、粉红等；清朝时出现了黑、蓝，同时过渡花色越来越丰富，花瓣上有白色条纹、放射状线纹、珠状斑点。现代，牡丹的花色在原有的基础上增加了雪青及复色等。目前已形成了红、粉、紫、白、黄、黑、绿、蓝、复色等色系。各色系又派生出不同的近似色、过渡色，如红色系有桃红、脂红、肉红、紫红等；白色系有洁白、牙白、粉白等；黄色系有淡黄、暖黄、米黄、金黄等；紫色系有深紫、红紫、粉紫、浅黄紫等；雪青色还有淡雪青色等

[55]

。

花色是牡丹的重要观赏形状之一，同时也是品种分类的重要指标之一。花色

的科学测量和定量分析是观赏植物花色研究中不可缺少的一部分。长期以来，牡丹花色的评价主要依靠人为观测和定性描述，具有很大的主观性和随意性。仪器测色法将花色数量化，有利于花色的精确测定，在园艺植物花色测量上使用十分广泛，曾被用于菊花、洋桔梗、月季、香石竹、兰花、蝶豆、矮牵牛、芍药等花卉的花色测定[56]。Wang[57]和Zhang等[58]采用色差仪分别测定了中原牡丹、西北牡丹的花色表型。本章利用分光色差仪按国际照明委员会（International Commission on Illumination，CIE） 表色系统对94个中原牡丹品种的花色进行测定，并在此基础上，通过CLUSTER过程，采用Ward离差平方和法将花色三刺激值L*、 a* 和b*进行了聚类分析。本研究为深入研究牡丹花色提供了前提条件，对于牡丹品种分类、新品种鉴定、花色遗传育种、牡丹种质资源保护等均具有重要意义。

2.2 实验材料与方法

2.2.1 实验材料

11

河南科技大学硕士论文

牡丹花于2009年4月10日和4月18日采自洛阳市土桥花木种苗有限公司和国家牡丹园，共94个品种（品种名及编号见表2-1）。

2.2.2 牡丹花色的测定

花朵采集后取新鲜花瓣，用色差仪（NF333 spectrophotometer, Nippon denshokn，光源C/2°） 按国际照明委员会（International Commission on Illumination, CIE）表色系统测定花色。花色的CIE表色系统的明度L*值、色相a*值、色相b*值在三维色度坐标系上，L*轴垂直于a*轴、b*轴组成的平面。L*值从0到100的变化过程中，表示明度由黑变亮逐渐增加；红绿属性a*值由负值变化到正值，表示绿色减退红色增强；黄蓝属性b*值由小变大，表示蓝色的减退黄色的增强。彩度C*和色相角h分别根据公式C*=(a*2+b*2)1/2 和h=arctan(b*/a*)计算。C*值表示到L*轴的垂直距离，距离越大，彩度越大[59]。每个品种均取5个不同植株上的花瓣，每瓣测定3个位置，对准集光孔进行测量，然后取平均值。

2.2.3 数据分析

利用SAS软件（9.0版本），通过CLUSTER过程将CIE表色系统的L*、 a* 和b*采用Ward离差平方和法进行聚类分析[60]。利用Microsoft Excel 软件分析花色的三刺激值之间的关系。

2.3 结果与分析

2.3.1 中原牡丹品种花色的测定

经过多年的培育和驯化，牡丹具有越来越多的观赏性状，花色表现尤为突出。目前已形成了红、粉、紫、白、黄、黑、绿、蓝、复色等色系。各色系又派生出不同的近似色、过渡色，如红色系有桃红、脂红、肉红、紫红等 [55]。以洛阳牡丹为代表的中原牡丹品种群是我国最大的牡丹品种群，是中国牡丹的精华所在。本文采用分光色差仪对94个中原牡丹品种的花色进行测定分析，结果如表2-1所示：94个品种牡丹花色在CIE表色系统坐标系上分布广泛，红绿属性a*值的范围介于-10.04~49.38之间，黄蓝属性b*值介于-18.97~37.15之间，亮度L*值介于23.17~88.99之间。

2.3.2 中原牡丹品种花色的聚类分析

聚类分析（cluster analysis）是一组分类方法的总称，是对变量或观察个体

12

第2章 牡丹花色测定及其表型分析

进行归类的统计方法，即把相似的变量或观察个体归为一类，而有较大差异的则归到不同的类别[60]。本文将94个中原牡丹L*、 a* 和b* 通过CLUSTER过程

表 2-1 94个中原牡丹品种花色的测定值

Table 2-1 Petal coloration of 94 cultivars of Zhangyuan tree peony

CIEL*a*b* coordinate1 2

Cultivar CS

L* a* b* C*

三变赛玉 白 88.57 -4.98 9.59 10.81 香玉 白 88.05 -6.27 9.28 11.19 玉楼点翠 白 87.54 -5.37 10.25 11.57 凤丹白 白 86.94 -6.32 10.81 12.52 白雪塔 白 88.17 -6.58 10.54 12.42 池塘晓月 白 87.82 -7.16 11.18 13.27 金玉交章 白 85.81 -5.85 12.21 13.54 黄花魁 白 82.36 -2.91 12.63 12.95 夜光白 白 88.02 -8.66 12.73 15.39 黄金轮 白 87.84 -8.01 13.44 15.64 中秋月光 白 88.44 -8.42 13.27 15.71 白玉 白 87.72 -7.78 12.26 14.52 黄金盏 白 87.38 -7.26 12.79 14.70 种生黄 白 87.07 -7.42 14.10 15.93 金贵飘香 白 88.99 -9.16 14.70 17.32 白鹤卧雪 白 87.58 -3.63 8.36 9.11 冰壶献玉 白 87.08 -4.78 7.67 9.03 蓝宝石 白 86.09 -4.41 7.87 9.02 紫斑牡丹 白 84.73 -1.21 7.55 7.65 蓝田玉 白 85.34 -0.41 5.34 5.36

豆绿 绿 73.84 -10.04 37.15 38.48 赵粉 浅粉 75.95 18.13 1.60 18.20 粉中冠 浅粉 77.09 15.39 2.29 15.56 银粉金鳞 浅粉 74.50 15.44 0.71 15.46 叔仲红 浅粉 78.02 11.06 3.16 11.50 种生凤丹 浅粉 79.84 5.52 1.81 5.80 池兰 浅粉 81.60 4.20 1.50 4.46 粉色凤丹 浅粉 80.98 5.75 3.72 6.85 雨后风光 浅粉 82.18 1.11 2.86 3.07 银红楼 粉红 65.83 28.13 -6.78 28.94 银红巧对 粉红 69.15 26.53 -3.07 26.70 肉芙蓉 粉红 69.55 25.50 -4.32 25.86 贵妃出浴 粉红 68.18 28.06 -2.10 28.14 鲁粉 粉红 74.23 20.60 0.05 20.60 贵妃插翠 粉红 72.25 21.14 -1.13 21.17

Number 1

7 10 2 3 18 12 14 5 13 16 6 15 17 19 4 8 11 9 61 94 35 36 44 63 58 62 59 60 34 37 38 39 40 41

h 117.44 124.04 117.65 120.32 121.97 122.63 115.60 102.96 124.22 120.79 122.38 122.41 119.56 117.76 121.91 113.48 121.92 119.28 99.07 94.34 105.12 5.04 8.45 2.61 15.93 18.17 19.59 32.87 68.79 -13.55 -6.59 -9.62 -4.27 0.14 -3.06

13

河南科技大学硕士论文

续表 2-1 Continued 2-1

CIEL*a*b* coordinate1

L* a* b* C* 72.80 21.60 -2.73 21.77 68.87 29.30 2.04 29.37 67.49 17.98 -6.76 19.21 71.19 17.61 -5.27 18.38 70.38 13.50 -6.26 14.88 66.12 26.56 -9.72 28.28 62.46 25.13 -11.69 27.71 59.10 25.27 -12.27 28.08 60.69 30.80 -11.36 32.83 60.89 31.41 -9.92 32.93 61.65 32.62 -13.44 35.28 63.10 21.21 -14.07 25.45 64.58 19.87 -11.81 23.11 68.64 19.97 -9.76 22.22 68.19 21.74 -9.28 23.63 55.11 43.64 -1.36 43.66 57.60 44.30 -0.66 44.30 58.02 42.94 -0.58 42.94 58.06 43.69 -1.48 43.71 61.42 39.31 -0.57 39.31 60.96 44.45 2.93 44.54 59.27 36.69 -4.80 37.00 48.03 49.38 -4.76 49.61 50.43 47.84 -5.34 48.14 52.33 47.12 -4.29 47.31 52.20 48.94 1.50 48.96 51.18 46.92 4.37 47.12 54.73 48.99 3.89 49.14 48.47 48.61 7.62 49.20 54.31 40.40 -11.61 42.03 54.55 37.75 -11.76 39.54 56.13 38.09 -11.51 39.79 57.54 37.95 -12.07 39.82 57.09 37.95 -14.79 40.73 50.07 32.82 -17.88 37.37 49.11 30.87 -18.44 35.96 46.33 34.90 -15.00 37.99 43.60 34.23 -17.20 38.30 52.95 26.79 -16.55 31.49 56.19 27.03 -18.18 32.57

Number 43

42 49 54 77 50 47 53 64 70 67 48 55 51 52 20 22 24 29 30 23 21 25 28 33 26 27 31 32 65 68 71 69 66 72 74 78 81 73 76

14

Cultivar 春红娇艳 宏图

蓝线界玉 少女裙 葛巾紫 彩绘

银鳞碧珠 紫兰魁 珠沙垒 苹实艳 似荷莲 胜葛巾 酒醉杨妃 凌花湛露 雁落粉荷

少女妆 丛中笑 飞燕红妆 胡红 珊瑚台 山花烂漫 映日红 红宝石 卷叶红 万花盛 胭脂红 火炼金丹 虞姬艳妆 种生红

鲁荷红 红莲 十八号 映红

富贵满堂 锦袍红 茄兰丹砂 盘中取果 映金红 魏紫 赵紫

CS2 粉红 粉红 粉红 粉红 粉红 粉蓝 粉蓝 粉蓝 粉蓝 粉蓝 粉蓝 粉蓝 粉蓝 粉蓝 粉蓝 红 红 红 红 红 红 红 红 红 红 红 红 红 红 紫 紫 紫 紫 紫 紫 紫 紫 紫 紫 紫

h -7.19 3.97 -20.60 -16.66 -24.86 -20.10 -24.95 -25.89 -20.24 -17.52 -22.38 -33.56 -30.73 -26.05 -23.11 -1.79 -0.85 -0.77 -1.93 -0.82 3.77 -7.45 -5.51 -6.36 -5.20 1.75 5.32 4.53 8.91

-16.04 -17.30 -16.82 -17.64 -21.29 -28.58 -30.84 -23.26 -26.68 -31.71 -33.92

第2章 牡丹花色测定及其表型分析

续表 2-1 Continued 2-1

CIEL*a*b* coordinate1

L* a* b* C* 41.81 42.97 41.09 41.54 39.83 35.09 35.83 29.97 23.17 32.20 29.19 26.74 31.13 32.13 33.30

42.08 40.37 40.57 42.00 38.75 40.58 37.87 35.76 28.18 40.91 39.45 34.34 39.02 37.49 35.86

-16.01 -16.24 -14.01 -12.27 -18.97 -17.21 -18.34 0.84 -0.28 -8.08 -3.78 -6.96 -11.47 -13.15 -10.96

45.02 43.51 42.92 43.75 43.14 44.07 42.07 35.77 28.18 41.70 39.63 35.04 40.67 39.73 37.50

Number 75 79 84 89 80 82 83 85 90 86 87 93 88 92 91

1

Cultivar 车轮紫 洛阳红 五洲红 乌龙捧盛 红狮子 首案红 春归华屋

状元红 魔剪绒 藏枝红 锦绣球

青龙卧墨池 大棕紫 源红蔷 八宝镶

CS2 红紫 红紫 红紫 红紫 红紫 红紫 红紫 红黑 红黑 红黑 红黑 红黑 红黑 红黑 红黑

h -20.83 -21.91 -19.05 -16.29 -26.08 -22.98 -25.84 1.34 -0.56 -11.17 -5.47 -11.46 -16.38 -19.32 -16.99

L*:亮度(lightness); C*:彩度( chroma (brightness)); a*, b*:色相(chromatic components); h: 色相角( hue

angle (°)). 2

CS: 色系(color series).

图 2-1 94个中原牡丹品种花色的聚类图

Fig. 2-1 Dendrogram of 94 cultivars of Zhangyuan tree peony obtained by Wards minimum

variance cluster analysis

注：图中横坐标中牡丹品种编号同表2-1。

15

河南科技大学硕士论文

采用Ward离差平方和法进行聚类分析。根据聚类过程中统计量（R2、半偏R2和伪F）结果的分析， 94个中原牡丹可分为9类；结合目测，9类牡丹花色分别描述为：白（20种）、绿（1种）、浅粉（8种）、粉红（13种）、粉蓝（12种）、红（14种）、紫（11种）、红紫（7种）、红黑（8种），聚类图见图2-1。

以色相a*值为横坐标、色相b*值为纵坐标做图，可看出9类牡丹花色在坐标系上的分布情况有显著差异，见图2-2和表2-2。可看出，中原牡丹的L*值按照白→浅粉→粉红→粉蓝→红→紫→红紫→红黑色系顺序依次降低。白色系牡丹的L*值和b*值最大，同时具有最小的a*值和较小的C*值。浅粉、粉红、红色系牡丹的a*和C*值依次显著增加，b*的绝对值均较小，其中红色系牡丹具有最大的a*值和C*值，且b*值的变异较大。粉蓝、紫、红紫色系牡丹的a*、b*和C*值依次增加，且b*值明显低于其它色系。红黑色系牡丹的a*、C*接近紫色，b*接近粉红色系，同时具有最小的L*值。

40.0白色绿色浅粉色粉红色粉蓝色红色紫色红紫色红黑色30.0b*20.010.00.0-20.0-10.0-10.00.010.020.030.040.050.060.0a*-20.0-30.0图2-2 94个中原牡丹品种花色的CIEL*a*b*分布图

Fig. 2-2 Distribution of flower color of 94 cultivars of Zhangyuan tree peony based on CIEL*a*b*

coordinates

16

第2章 牡丹花色测定及其表型分析

表 2-2 不同色系中原牡丹的品种花色测定值1

Table 2-2 Petal coloration of different groups of Zhangyuan tree peony1

CIEL*a*b* coordinate2 4

NC

L* A* b* C* h

20 87.07±1.56 -5.83±2.40 10.83±2.55 12.38±3.16 116.99±8.43 1 73.84 -10.04 37.15 38.48 105.12 8 78.77±2.81 9.57±6.27 2.20±0.99 10.11±5.81 21.43±21.43 13 70.17±2.31 21.71±5.31 -4.08±3.25 22.42±4.82 -12.06±10.53 12 63.72±2.99 25.84±4.48 -11.42±1.51 28.33±4.20 -24.24±4.49 14 54.84±4.49 45.20±3.82 -0.25±3.92 45.35±3.87 -0.46±4.84 11 52.53±4.64 34.43±4.62 -15.00±2.83 37.78±3.30 -24.01±6.64 7 39.73±3.08 40.31±1.56 -16.15±2.36 43.50±0.93 -21.85±3.53 8 29.7275±3.36 36.37±3.97 -6.73±5.22 37.27±4.35 -10.00±7.73

CS3 白

绿 浅粉 粉红 粉蓝 红 紫 红紫 红黑

1 2

Data in the table showed mean±standard deviation.

L*:亮度(lightness); C*:彩度( chroma (brightness)); a*, b*: 色相(chromatic components); h:色相角( hue angle (°)). 3

CS: 色系(color series). 4

NC: 品种序号(number of cultivars)

本实验中，传统的黄色品种没有被单独聚为一类，而分散在白色系品种中。这主要是因为中原牡丹缺少真正的黄色品种，多数黄色品种颜色很淡，花色介于白色向黄色的过渡色。本文同时测定了从日本引进的黄色品种“海黄”的花色，其L*、 a* 和b*分别为86.92、-15.17和43.33，C*为46.01，色相角h为109.24，其黄蓝属性b*和彩度C*值均显著高于我国黄色品种。“豆绿”是我国少数绿色品种的代表，其花色b*为37.15，显著高于其它品种， a*值为-10.04，在所测品种最小。中原牡丹纯色花品种较少，多为过渡色，尤其缺乏真正的黄、绿、蓝及鲜红色品种。纯色花的花色比较好判定，而一些中间色的目测判断是比较困难的。本章的研究表明，依据L*、 a* 和b*的聚类分析可将包括过渡色在内的多数不同色系品种较好地分类。从而有利于牡丹品种分类、新品种鉴定、花色遗传育种、牡丹种质资源保护等研究。 2.3.3 中原牡丹品种花色三刺激值之间的关系

L* 是衡量花色明暗程度的指标，a*和b*是决定花色的两个重要因子，同时a*、b*以及由其计算出来的彩度C*的变化会对亮度L*产生影响[56]。从图2-3可以看出，除红黑色系外，牡丹花色的亮度值L*和a*、亮度值L*和C*均表现出显著的负相关性，且相关关系因花色不同而异。白、浅粉、粉红、红色系的L*与a*、L*与C*的相关系数R2分别为0.9703和0.8519，粉蓝、紫、红紫色系的L*与a*、L*与C*的相关系数R2分别为0.6067和0.714。此外，除红和红黑色系外，其它色系的L*与b*呈显著的正相关关系，R2为0.8653。

17

河南科技大学硕士论文

y = -1.5492x + 130.03(R2 = 0.9703 n=55)白色绿色浅粉色粉红色粉蓝色红色紫色红紫色红黑色a*60.050.040.030.020.010.00.0-10.0-20.00.010.020.030.040.0y = -0.5456x + 61.843(R2 = 0.6067 n=30)50.060.070.080.090.0100.0L*

白色绿色浅粉色粉红色粉蓝色红色紫色红紫色红黑色b*50.040.030.020.010.00.0-10.0-20.0-30.00.010.020.030.040.050.060.070.080.090.0100.0y = 0.6386x - 47.405(R2 = 0.8653 n=71)L*

y = -1.0227x + 98.15(R2 = 0.8519 n=55)白色绿色浅粉色粉红色粉蓝色红色紫色红紫色红黑色C*60.050.040.030.020.010.00.00.020.040.0y = -0.5878x + 67.0892(R = 0.714 n=30)60.080.0100.0L* 图2-3 中原牡丹CIE L*a*b*表色系统的花色测定值之间的关系

Fig. 2-3 Relationship between CIE L*a*b* coordinates of petal colols Zhangyuan tree peony

cultivars

18

第2章 牡丹花色测定及其表型分析

2.4 结论

94个中原牡丹品种花色在CIE表色系统坐标系上的分布广泛，聚类分析将其分为9个色系：白（20种）、绿（1种）、浅粉（8种）、粉红（13种）、粉蓝（12种）、红（14种）、紫（11种）、红紫（7种）、红黑（8种），不同色系牡丹的L*、 a* 和b*值特征明显。白、浅粉、粉红和红色系以及粉蓝、紫和红紫色系的L*与a*、L*与彩度（C*）均表现出显著的负相关性（L*与a*的相关系数R2分别为0.9703和0.6067，L*与C*的相关系数R2分别为0.8519和0.714）；多数色系牡丹（除红和红黑外）的L*与b*呈显著的正相关关系（R2为0.8653）。

19

第3章 HPLC法检测牡丹花色苷种类与含量

第3章 牡丹花色苷的种类与含量

3.1 引言

花色素是花色形成的物质基础。牡丹花色素属于类黄酮化合物，主要有花色苷、黄酮和黄酮醇的苷类[57,61,62]。本实验室已利用高效液相色谱与二极管陈列检测器和电喷雾电离质谱联用技术（HPLC-DAD-ESI-MS）分离鉴定了少数几个品种牡丹花中的花色苷类化合物[63]，分别为矢车菊色素-3, 5-O-二葡萄糖苷（Cy3G5G），矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷（Cy3G）、芍药色素-3, 5-O-二葡萄糖苷（Pn3G5G）、芍药色素-3-O-葡萄糖苷（Pn3G）和天竺葵-色素3, 5-O-二葡萄糖苷（Pg3G5G）。

本章采用HPLC-DAD-ESI-MS方法检测了不同色系48个中原牡丹品种的花色苷的含量和种类，分析了不同色系牡丹花色苷含量和各单体花色苷相对丰度的特点；并结合第2章的花色测定结果，分析了牡丹花色与花色苷含量和种类的关系，为牡丹花色育种以及牡丹资源的综合开发提供科学依据。

3.2 材料与方法

3.2.1 材料、仪器与试剂

实验材料：牡丹花采自洛阳市土桥花木种苗有限公司和国家牡丹园。按花期不同，采集时间分别为：2009年4月10日和2009年4月18日。共8个色系48个品种，品种名及编号见表3-1。

主要设备：HH-4恒温水浴锅（江苏金坛市亿遍电子有限公司），FA/JA电子天平（上海上平仪器公司），101-2A电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SHB-Ш型循环水式多用真空泵（陕西鹏展科技有限公司），PHS-3C型精密pH计（上海金鹏分析仪器有限公司），SY3200-T超声波清洗仪（上海生源仪器设备有限公司），高效液相色谱-质谱联用仪(Waters 2690)、Waters 996 DAD（美国Waters公司）、Amberlite XAD-7(美国罗门哈斯公司)。

主要试剂：矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷为Sigma公司产品，甲醇、乙酸乙酯、盐酸等以及其他试剂均为国产分析纯。

20

河南科技大学硕士论文

3.2.2 实验方法

(1) 花色苷提取

采摘盛花期的牡丹花，去柄去蕊，称取鲜嫩完好的花瓣1 g，剪碎，加入25 mL无水甲醇，避光4℃浸提12 h。3000 r·min-1离心5 min，取上清液，为牡丹花色苷提取液。

(2) 牡丹花色素提取液中花色苷含量的测定

色谱柱：Waters Sunfire C18 （2.1×150mm，5μm）；流动相A液：1％乙酸，B液：甲醇。线性梯度洗脱：0?20 min, B液0?80%；20?30 min, B液80?100%。流速：0.3 mL·min-1。柱温35 ℃，进样量20 μL。DAD检测器，花色苷检测波长520nm。 质谱条件：正离子扫描（ESI+，m/z 100-1000），毛细管电压：3.8kV；锥孔电压：30V；光电倍增器电压：650V；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：300℃；检测分流比1：5。根据各色谱峰的紫外吸收光谱、质谱、保留时间等信息，结合文献报道，并与标准品相对照，确定具体花色苷的种类，详见参考文献[63]；并采用峰面积归一化法[61,62,64]计算不同品种牡丹花瓣中所含不同种类花色苷的相对丰度。花色苷总量测定以矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷为标样，采用外标法定量。

3.2.3 数据分析

利用SAS软件(9.0版本)，结合第2章测定的牡丹花色的数据和本章花色苷种类和含量的几个变量，分析表示牡丹花色的三刺激值与花色苷测定值之间的相关性，研究牡丹花色与花色苷之间的关系。

3.3 结果与分析

3.3.1不同色系中原牡丹花色苷总含量和组成分析

花色是牡丹重要的观赏性状之一，而花色素则是牡丹花色形成的物质基础。牡丹花色素属于类黄酮化合物，主要有花色苷、黄酮和黄酮醇的苷类[57,61,62]。本实验室已利用高效液相色谱与质谱联用技术分离鉴定了少数几个品种牡丹花中的花色苷类化合物[63]。本章选取48个中原牡丹品种，包括白（8种）、黄（5种）、粉红（6种）、粉蓝（6种）、红（12种）、紫（5种）、红黑（3种）、红紫（3种），采用高效液相色谱与质谱联用方法分别对48个中原牡丹品种的花色苷进行了分析鉴定，测定了花色苷的总含量，并采用峰面积归一化法计算不同品种所含各花色苷单体的相对丰度，结果见表3-1。

21

第3章 HPLC法检测牡丹花色苷种类与含量 表3-1 不同品种中原牡丹的花色苷总含量、花色苷单体相对含量1

Table 3-1 Totle anthocyanin content and relative abundance of individual anthocyanins of different cultivars of Zhangyuan tree peony1

Cy Pg Pn Cy Pg Pn 3G5G 3G

品 种

3G5G 3G 3G5G 3G 3G5G 3G

白鹤卧雪 白雪塔 白玉 冰壶献玉 凤丹白 三变赛玉 香玉 玉楼点翠

平均值 标准差

池塘小月 黄金轮 金玉交章 中秋月光 种生黄

平均值 标准差

彩绘 4.90 - - - 90.50 4.60 4.90 - 95.10 95.40 4.60 苓花沾露 6.14 - - - 90.5 3.36 6.14 - 93.86 96.64 3.36 胜葛巾 5.26 - 6.56 - 83.98 4.2 5.26 6.560 88.18 95.80 4.20 雁落粉荷 13.22 - 3.54 - 83.24 - 13.22 3.54 83.2 100 -

花色 白色2

黄色2 粉蓝色

TA (×100) 0.03 0.20 0.03 0.07 0.18 0.35 0.00 0.00 0.11 0.13 0.47 0.00 0.25 0.12 0.24 0.22 0.18 1.69 3.00 1.19 3.95

22

河南科技大学硕士论文 续表3-1 Continued 3-1

Pg Pn 3G5G 3G 3G5G 3G - - 79.53 10.48 - - 64.16 15.59 1.68 0.00 81.99 6.37 2.78 0.00 9.74 5.65 93.83 - 4.73 - 51.63 - 13.66 13.94 97.5 - 2.58 - 95.34 - 2.5 - 74.09 - 23.71 1.2 86.15 - 5.97 1.73 83.09 0.00 8.86 2.81 17.62 0.00 8.35 5.50 64.68 - 18.14 - 93.38 - 3.85 - 54.47 - 41.24 2.41 98.5 - 0.4 - 61.18 - 9.57 18.11 53.29 - 43.86 2.85 100 - + - 58.54 - 12.68 12.63 80.32 - 8.12 2.59 100 - + -

花色

粉红色 红色

品 种 银鳞碧珠 紫兰魁 平均值 标准差

贵妃插翠 贵妃出浴 鲁粉 肉芙蓉 银红楼 银红巧对 平均值 标准差

丛中笑 飞燕红妆 红宝石 胡红 火炼金丹 卷叶红 山花烂漫 少女妆 万花盛 胭脂红

Cy 3G5G 3G 3.94 6.05 9.99 10.26 7.24 2.72 3.60 4.42 - - 3.62 15.46 - - - - 1.01 - 4.44 1.72 1.51 2.86 2.01 6.21 14.09 3.1 - 2.77 1.88 - - - - 11.14 - - - - 2.91 12.86 2.54 6.43 - -

Cy 9.99 20.25 9.96 5.98 - 19.08 - - 1.01 6.16 4.38 7.59 17.18 2.77 1.88 - 11.14 - - 15.77 8.97 - Pg - - 1.68 2.78 93.83 51.63 97.5 95.34 74.09 86.15 83.09 17.62 64.68 93.38 54.47 98.5 61.18 53.29 100 58.54 80.32 100 Pn 90.01 79.76 88.35 5.98 4.73 27.6 2.6 2.5 24.9 7.7 11.67 11.48 18.14 3.85 43.65 0.4 27.68 46.71 + 19.31 10.7 + 3G5G 83.47 74.15 90.91 9.96 98.56 68.91 100.1 97.84 98.8 96.55 93.46 12.08 96.9 97.23 97.59 98.9 70.75 97.15 100 74.13 90.98 100 3G TA

2.76 16.53

4.26 25.85

9.09 2.81 9.96 1.21

1.41 -

5.56 29.39

0.99 -

1.77 -

2.61 1.2

1.92 3.45

5.67 2.38 11.70 1.65

4.04 3.1

4.71 2.77

8.47 2.41

5.98 -

29.25 10.42

7.97 2.85

3.51 -

4.97 25.49

3.82 9.02

6.52 -

23

第3章 HPLC法检测牡丹花色苷种类与含量 续表3-1 Continued 3-1

Pg Pn 3G5G 3G 3G5G 3G 89.51 - 2.99 4.72 94.8 - 5.2 - 79.06 0.00 14.61 3.61 19.15 0.00 15.60 5.83 - - 53.72 12.28 - - 72.91 9.49 - - 69.6 8.94 0.00 0.00 65.41 10.24 0.00 0.00 10.26 1.79 - - 84.07 2.07 - - 55.96 13.71 - - 41.8 20.58 0.00 0.00 60.61 12.12 0.00 0.00 21.52 9.36 - - 78.03 4.35 2.73 - 83.36 4.87 - - 69.78 18.52 - - 70.87 9.84 - - 50.3 21.03 0.55 0.00 70.47 11.72 1.22 0.00 12.56 7.71

花色 红黑色 红紫色 紫色

品 种 映日红 虞姬艳妆 平均值 标准差

青龙卧墨池 大棕紫 源红蔷 平均值 标准差

红狮子 洛阳红 首案红 平均值 标准差

葛巾紫 富贵满堂 锦袍红 魏紫 盘中取果 平均值 标准差

Cy 3G5G 3G - 2.77 - - 1.79 3.26 4.03 4.56 22.83 11.16 13.62 3.99 18.37 3.08 18.27 6.08 4.61 4.43 13.86 - 22.56 7.76 13.66 23.96 16.69 15.86 5.08 11.46 17.62 - 7.55 - 11.7 - 12.58 5.35 12.39 16.28 12.37 4.33 3.58 7.07

Pg

2.77 89.51 - 94.8 5.04 79.06 6.48 19.15 34 - 17.61 - 21.45 - 24.35 0.00 8.57 0.00 13.86 - 30.32 - 37.61 - 27.26 0.00 12.17 0.00 17.62 - 7.55 2.73 11.7 - 17.92 - 28.67 - 16.69 0.55 7.97 1.22

Cy

Pn 7.71 5.2 18.34 16.36 66 82.39 78.55 75.65 8.57 86.14 69.68 62.39 72.74 12.17 82.38 88.23 88.3 80.71 71.33 82.19 6.96 3G5G 92.5 100 93.01 10.04 76.55 86.52 87.97 87.68 6.22 97.93 78.52 55.46 77.30 21.26 95.65 93.63 81.48 83.45 62.69 83.38 13.11 3G 7.5 - 6.87 10.04 23.45 13.48 12.03 16.32 6.22 2.07 21.48 44.54 22.70 21.26 4.35 4.87 18.52 15.19 37.31 16.05 13.42 TA 7.67 6.47 6.21 2.13 28.95 16.76 26.08 23.93 6.37 16.94 15.70 8.00 13.55 4.84 4.60 2.57 6.56 9.03 15.87 7.73 5.14

24

河南科技大学硕士论文

1

TA : Totle anthocyanin content , mg cyanidin 100 g-1 FW; relative abundance of individual anthocyanins, %. Pn: peonidin; Cy: cyanidin; Pg: pelargonidin; 3G5G: 3,5-di-O-glucoside; 3G: 3-O-glucoside. Data are expressed as percentage. +: less than 0.45%; _: not detected. 2

Relative abundance of individual anthocyanins of cultivars in the color group is not analyzed due to their lower TA.

从表3-1可看出，不同品种、色系中原牡丹花色苷总含量差异较大。其中红黑系花色苷平均含量最高，为239.3 mg/100g，其次为红紫色、紫色、红色、粉蓝色和粉红色系，花色苷平均含量依次为：135.5、77.3、62.1、28.1、23.8 mg/100g。白色系和黄色系花色苷平均含量较低，分别为1.1、2.2mg/100g，仅为红黑色系牡丹花色苷含量的4.6‰和9.2‰；白色系中‘三变赛玉‘和黄色系中

矢车菊素-3,5-O-二葡萄糖苷 矢车菊素-3-O-葡萄糖

芍药色素-3,5-O-二葡萄糖苷 芍药色素-3-O-葡萄糖苷

天竺葵素-3,5-O-二葡萄糖苷

图 3-1 中原牡丹花中含有的5种花色苷

Fig. 3-1 Five different anthocyanins of Zhongyuan tree peony

25

第3章 HPLC法检测牡丹花色苷种类与含量

‘池塘晓月’的花瓣基部带有浓斑，其花色苷含量相对较高，分别为3.5和4.7 mg/100g，说明这两个品种的花色苷主要存在于花瓣基部花斑部分。

48个品种中原牡丹共检测到5种花色苷，分别为芍药色素-3,5-O-二葡糖苷（Pn3G5G）、矢车菊色素-3,5-O -二葡糖苷（Cy3G5G）、天竺葵色素-3,5-O -二葡糖苷（Pg3G5G）、芍药色素-3-O -葡糖苷（Pn3G）和矢车菊色素-3-O -葡糖苷（Cy3G），结构式如图3-1所示。

中原牡丹不含天竺葵色素-3-O -葡糖苷（Pg3G），且以3,5-O -二葡糖苷（3G5G）含量较高。不同色系中原牡丹所含花色苷的主要种类有显著差异：粉红色和红色系以Pg3G5G为主，分别占总花色苷的88.09%、79.06%；其次为Pn类色素含量较低，分别占总花色苷含量的11.67%和18.34%，可以归入PgPn类；粉蓝色系、紫色系、红黑色系、红紫色系以Pn3G5G为主，分别占总花色苷含量的88.35%、82.19%、75.65%、72.74%；其次为Cy类色素，分别占总花色苷含量的9.96%、16.69%和24.35%、27.26%，仅含少量或几乎不含Pg类色素（见表3-1），归入PnCy类。由于白色系和黄色系品种花色苷含量很低，因此，未对其各花色苷单体的相对丰度作进一步分析。

不同色素种类及其含量的时空组合最终表现为花色，色素的颜色表现具数量效应[65]。本试验中，粉色系和红色系牡丹花色苷均以Pg3G5G为主，但红色系牡丹花色苷是粉红色系的2.6倍；粉蓝、紫、红紫、红黑色系牡丹花色苷均以Pn3G5G为主，但总含量和Cy类色素含量依次显著增加，不仅使花色加深，同时，由于从天竺葵色素Pg到矢车菊色素Cy，B环上羟基数目增加，羟基的供电子作用使花色所显示的蓝色增加（最大吸收波长红移）[65]。

3.3.2 牡丹花色三刺激值与花色苷测定值的相关性分析

结合第2章测定的牡丹花色和本章测定的不同品种牡丹所含花色苷的结果，剔除有斑和白色牡丹花，选择了21种牡丹花，并且根据它们含有的主要花色苷的不同，分为PnCy类 （11种）和PgPn类 （10种），分别分析花色三刺激值L*、a*、b*与花色苷总量（TA）和花色苷单体的相关性（见表3-2和3-3）。

利用SAS软件(9.0版本)“分析家”通过逐步回归的方法分别分析花色三刺激值与牡丹花色苷总量与花色苷单体的相关性，结果见表3-4和表3-5。PnCy类牡丹花，亮度值L*与花色苷总量呈现出负相关性，即花色苷的含量越高，牡丹花的颜色就越深。影响L*的两种主要花色苷是矢车菊色素-3,5-O-二葡萄糖苷（Cy3G5G）和芍药色素-3,5-O-二葡萄糖苷（Pn3G5G），从回归方程看两种花色苷对亮度的影响是不一致的，从表3-2可以看出PnCy类牡丹花中Pn3G5G的含量远大于Cy3G5G，因此L*与TA呈现出了负相关性。a*值表示红绿属性，其与

26

河南科技大学硕士论文

花色苷总量没有显示出相关性，b*表示的黄蓝属性也与花色苷总量没有相关性。

表 3-2 PnCy类牡丹花花色与花色苷的测定值

Table 3-2 The value of colors and anthocyanins in PnCy tree peony

Cultivar 锦袍红 池兰 雁落粉荷 紫兰魁 源红蔷 葛巾紫 富贵满堂 银鳞碧珠 彩绘 藏枝红 大棕紫

TA(×100) L* 6.559 0.271 3.953 4.259 26.079 4.601 2.571 2.761 1.690 11.562 16.755

51.250 81.600 69.040 59.520 31.830 74.600 57.090 62.455 65.790 33.230 30.100

a* 32.060 4.140 20.560 25.290 37.090 15.520 37.945 25.125 26.230 40.680 38.460

b* 1.630 -8.820

Cy3G5G 0.000 0.523

Cy3G Pg3G5G Pn3G5G 4.577 0.271 3.291 2.733 18.151 3.590 2.143 2.196 1.529 9.257 12.216

Pn3G 1.215 0.000 0.000 0.664 2.331 0.200 0.125 0.289 0.078 0.760 1.590

-17.790 0.767 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.140 0.437 0.000 0.803 0.000 0.000 0.000 0.000 0.070 0.167 0.000 0.000 0.000 0.214 0.000 0.669 0.000

-12.800 0.426 -13.620 4.791 0.810

0.811

-14.790 0.194 -11.690 0.109 -9.920 -9.430 -9.880

0.083 1.331 2.282

注：表中“TA”表示花色苷总量；花色的三刺激值L*、a*、b*是每一品种牡丹花测得的平均值；Cy：矢车菊色素；Pg：天竺葵色素；Pn：芍药色素。3G5G和3G分别表示二葡萄糖苷和单葡萄糖苷。且它们的值是根据表3-1的相对值花色苷总量计算出的花色苷绝对值。

表 3-3 PgPn类牡丹花花色与花色苷的测定值

Table 3-3 The value of colors and anthocyanins in PgPn tree peony

Cultivar TA(×100) 赵粉

0.614

山花烂漫 3.510

6.522 胭脂红 鲁粉

0.993

贵妃插翠 1.408 5.987 胡红

虞姬艳妆 6.473 2.614 银红楼 红宝石 卷叶红

8.471 7.973

L* a* b* Cy3G5G 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.026 0.159 0.000

Cy3G Pg3G5G Pn3G5G Pn3G

75.580 19.510 1.550 61.550 43.900 2.920 53.040 50.550 2.740 73.570 21.940 0.010 73.500 19.450 -0.570 56.610 44.260 -3.490 55.110 48.720 4.050 66.190 26.160 -6.340 48.025 49.380 -4.760 50.170 48.100 -5.760

0.000 0.604 0.000 0.000 0.000 3.510 0.000 0.000 0.000 6.522 0.000 0.000 0.000 0.968 0.026 0.000 0.000 1.322 0.067 0.000 0.000 5.898 0.024 0.000 0.000 6.136 0.337 0.000 0.000 1.936 0.620 0.031 0.000 4.614 3.493 0.204 0.000 4.249 3.497 0.227

注：与表3-2一致。

PgPn类牡丹花表现出来的规律与PnCy类牡丹花并不完全一致。亮度值L*与花色苷总量（TA）负相关，影响亮度L*的两种花色苷天竺葵素-3,5-O-二葡萄糖苷（Pg3G5G）和芍药花素-3,5-O-二葡萄糖苷（Pn3G5G）具有一致的作用，即它们的含量越高牡丹花的颜色就越深。红绿属性a*与TA有相关性，即花色苷含量越高牡丹花的颜色就越偏向红色，其主要作用的两种花色苷分别是Pg3G5G和Pn3G。而黄蓝属性b*与TA没有相关性。

27

第3章 HPLC法检测牡丹花色苷种类与含量

表 3-4 PnCy类牡丹花花色与花色苷的回归分析

Table 3-4 The regression analysis between flower colors and anthocyanins in PnCy tree peony

花色与花色苷 L*与TA L*与花色苷单体 a*与TA a*与花色苷单体 b*与TA b*与花色苷单体

回归方程

L*＝70.0817－1.9047TA

L*＝78.4913+21.9470Cy3G5G－8.2603Pn3G5G a*＝21.1583+0.86799TA

a*＝15.2665-15.8373Cy3G5G+5.2436Pn3G5G b*＝-8.0343-0.2211TA

b*＝-4.4911+6.0363Cy3G5G-70.1124Pg3G5G-15.2324Pn3G

R2 0.7123 0.9086 0.3646 0.6086 0.0831 0.5955

显著性 0.0011 0.001 0.0492 0.0236 0.3899 0.0810

表 3-5 PgPn类牡丹花花色与花色苷的回归分析

Table 3-5 The regression analysis between flower colors and anthocyanins in PgPn tree peony

花色与花色苷 L*与TA L*与花色苷单体 a*与TA a*与花色苷单体 b*与TA b*与花色苷单体

回归方程

L*＝76.3556-3.4335TA

L*＝76.8219-3.6271Pg3G5G-54.4062Pn3G5G a*＝18.2623+4.2488TA

a*＝16.28869+5.3233Pg3G5G+40.4808Pn3G b*＝0.5042-0.3297TA

b*＝-0.9815+0.3871Pg3G5G-29.5594Pn3G

R2 0.9804 0.9821 0.8668 0.9336 0.0645 0.4724

显著性 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.4791 0.1067

3.4 结论

采用高效液相色谱与二极管陈列检测器和电喷雾电离质谱联用技术（HPLC-DAD-ESI-MS）分析了48个品种的中原牡丹花瓣中的花色苷总含量、种类以及各花色苷单体的相对丰度。结果表明：中原牡丹花中共含有基于天竺葵色素、芍药色素和矢车菊色素的五种花色苷，分别为矢车菊色素-3,5-O-二葡萄糖苷（Cy3G5G），矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷（Cy3G）、芍药色素-3,5-O-二葡萄糖苷（Pn3G5G）、芍药色素-3-O-葡萄糖苷（Pn3G）和天竺葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷（Pg3G5G），不含天竺葵色素-3-O-葡萄糖苷（Pg3G）。48个品种中原牡丹花色苷总含量变化范围为0~289.5mg/100g；不同色系牡丹花色苷单体的相对丰度差异显著，粉色和红色系品种以天竺葵素-3,5- O-二葡萄糖苷为主（相对丰度分别为88.09%和 79.06%），粉蓝色、紫色和红黑、红紫色系以芍药花素-3, 5- O-二葡萄糖苷为主（相对丰度分别为88.35%、82.19%和 75.65%、72.74%），矢车菊类色素在红紫和红黑色系牡丹中的相对丰度较大。

无论PnCy类还是PgPn类牡丹花，牡丹花色的亮度值L*与花色苷总量(TA)具有负相关性。在PnCy类中花色色度值a*和b*都与TA没有相关性，主要是因

28

河南科技大学硕士论文

为不同的花色苷单体对花色影响不一致引起的。PgPn类牡丹花的a*值与花色苷总量(TA)正相关，因为主要影响牡丹花色的两种花色苷单体均与a*值具有正相关性。

29

第4章 大孔吸附树脂法纯化牡丹花色苷工艺研究

第4章 大孔吸附树脂法纯化牡丹花色苷工艺研究

4.1 引言

大孔吸附树脂(Marcroporous Resin)是六十年代末发展起来的一类有机高聚物吸附剂，同时兼有吸附性和筛选性，是以吸附作用和筛选作用相结合的分离材料，其吸附作用是由于范德华力或产生氢键的结果，而筛选作用则是由树脂本身的多孔性结构所决定。大孔树脂可分为非极性、中极性和极性三大类。根据分离物质极性的大小，通过选择与之相适应的树脂达到分离与纯化的目的。目前大孔树脂在分离纯化天然产物方面的应用越来越广泛，如纯化黄酮、生物碱、多酚、花色苷等都有报道[66,67,68]。

目前为止，还未见通过大孔吸附树脂法纯化牡丹花花色苷的报道。本章研究了大孔吸附树脂纯化中原牡丹花色苷的特性，以期找到分离纯化牡丹花色苷的最佳树脂及纯化花色苷的工艺，为进一步开发利用牡丹资源提供科学依据和理论支持。

4.2 材料与方法

4.2.1 实验试剂和仪器

实验试剂：不同型号的大孔吸附树脂（厂家型号见表4-1），甲醇、石油醚、乙酸乙酯、盐酸、乙醇、乙酸钠、氯化钾等均为国产分析纯，蒸馏水自制。

主要仪器：RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）, HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂有限公司），BSZ-100电脑自动部分收集器（上海精科实业有限公司），722N可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）， PHS-3B型精密pH计（上海精密科学仪器有限公司），QYC-2102C上海福玛全温空气摇床（上海福玛实验设备有限公司），FA/JA电子天平（上海上平仪器公司）。

实验材料：牡丹花采自洛阳市土桥花木种苗有限公司，选择花色较深且种植范围较广的牡丹品种‘洛阳红’来进行研究。 4.2.2 实验方法

(1) 花色苷提取液制备

30

河南科技大学硕士学位论文

新鲜的牡丹花瓣用0.1% HCl甲醇溶液提取，提取液减压浓缩；浓缩液先用石油醚萃取，除去脂溶性杂质，萃取液放冰箱中备用；使用前用缓冲液稀释至所需浓度。

(2) 花色苷浓度的测定

花色苷含量测定采用pH示差法。取0.5mL待测液，分别用pH1.0 KCl缓冲液（125mL, 0.2MKCl：375mL, 0.2MHCl）和pH4.5醋酸钠缓冲液（400mL, 1MNaAc：240mL, 1MHCl：360mL, H2O2）稀释至5mL，室温下静置120 min，分别测定它们在520nm和700nm处的吸光值，根据朗伯/比尔定律, 参考Fuleki T的经验公式就可以测得花色苷的含量[69]。计算公式如下[70]：

花色苷浓度(mg/L)?A?MW?DF?1000 (式4-1)

ξ?1A=(Aλ520-Aλ700)pH1.0-( Aλ520-Aλ700)pH4.5 (式4-2)

式中，A为吸光值（其计算方法见式4-2）；MW＝449.2（为矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷的分子量）；DF为原样的稀释倍数；ξ＝29600，为矢车菊色素-3-O-葡萄糖苷在520nm的平均分子摩尔消光系数。

(3) 树脂预处理

20种不同型号的大孔吸附树脂（物理性质及编号见表4-1），乙醇浸泡24h，充分溶胀后用乙醇 洗涤，至洗涤液加适量蒸馏水无白色混浊现象，然后用蒸馏水洗至无醇味[71]。

表 4-1 不同型号大孔吸附树脂的物理性质 Table 4-1 Physical properties of macroporous resins

极性 粒径/mm 比表面积/m2·g

极性 极性 极性 极性 极性 极性 中极性 中极性 中极性 中极性 中极性 中极性 中极性 弱极性 弱极性

0.3-1.25 0.35-1.25 0.3-1.25 0.3-1.25 0.3-1.2 0.35-1.25 0.3-1.25 0.35-1.25 0.3-1.2 0.3-1.25 0.3-0.9 0.25-1.25 0.25-1.25 0.3-1.25 0.3-1.25

250-290 550-600 ≥150 540-580 550-600 ≥550 500-550 380-500 500-550 ≥330 450 400-600

- 480-520 ≥400

树脂名称

南开化工NKA-9 西安蓝深LS-45 天津大均D-201 南开化工D-4020 沧州宝恩HPD-600 安徽三星D-1300 沧州宝恩DM130 西安蓝深LSA-10 沧州宝恩HPD-400 天津大均D-301 Amberlite XAD-7 南开化工D-101 西安蓝深LSA-40 沧州宝恩AB-8 天津大钧D-101

平均孔径/nm 15.5-16.5

- 80.9 10-10.5 80 - 90-100 8.5-9 75-80 33.5 45-50 10.0-12.0

- - 93.1

31

第4章 大孔吸附树脂法纯化牡丹花色苷工艺研究

续表 4-1 Continued 4-1 粒径/mm 0.35-1.25 0.3-1.25 0.3-1.25 0.3-1.25 0.3-1.25

树脂名称

西安蓝深LS-303 天津大钧D-401 安徽三星X-5

沧州宝恩HPD-826 沧州宝恩ADS-17 极性 弱极性 弱极性 非极性 氢键 氢键

比表面积/m2·g 500-700 ≥480 500-600 500-600 90-150

平均孔径/nm

- - 29.0-30.0 90-10 25-30

(4)静态吸附及解吸实验 ① 树脂筛选

花色苷提取液用pH2.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释10倍，得到浓度为0.141mg·mL-1花色苷样品液，备用。准确称取20种型号的湿树脂各3g，置于250mL三角烧瓶中，各加30mL花色苷样品液，置于水浴摇床上，25℃、120r·min-1振荡12h，抽滤，再各用30mL 90％乙醇于25℃、120r/min摇床上振荡12h，洗脱各树脂吸附的花色苷，过滤。分别测定滤液及洗脱液中花色苷的含量，计算各树脂的吸附量、吸附率及解析量、解析率（吸附量和吸附率参照式4-3和式4-4）。

Q1?D?C2?V2 (式4-5) mC2?V2?100 (式4-6)

(C0?C1)?V1式中，Q1为解析量，mg·g-1；C2为解析液中花色苷浓度，mg·L-1；V2为解析液体积，L；D为解析率，%。

② 上样pH值的测定

准确量取牡丹花提取液5mL，花色苷浓度为1.141mg·mL-1，8份，分别用pH值2.2、2.6、3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（缓冲液配置见表4-2）稀释至50mL（稀释前后样液pH变化很小，可忽略不计），备用。称取某一种吸干表面水分的湿树脂（南开化工D-101）3g，8份，分别置于250mL三角烧瓶中，各加入不同pH缓冲液稀释的提取液30mL，置于水浴摇床上，25℃、120r·min-1振荡12h，抽滤，测定滤液中花色苷的总量，计算吸附量和吸附率。

Q?(C0?C1)V1 (式4-3) m32

河南科技大学硕士学位论文

E?C0?C1?100 (式4-4) C0式中，Q为吸附量，mg·g-1；C0为牡丹花提取液中花色苷初始浓度，mg·L-1；C1为吸附液花色苷浓度，mg·L-1；V1为加入的原液体积，L；m为树脂质量，g；E为吸附率，%。

以吸附率对pH值作图，选择最适的pH值缓冲液稀释提取液。

表4-2 不同pH值磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配置

Table 4-2 Configuration buffer of different pH value

2.2 2.6 3.0 3.4 4.0 4.4

3.637

pH值 5.0 6.0

磷酸氢二钠(0.2mol·L-1, mL)

柠檬酸(0.1mo·L-1, mL)

10.900 20.552 28.500 40.035 44.100 51.500 63.152

96.363 89.100 79.448 71.500 59.965 55.900 48.500 36.848

○3 静态吸附动力学研究

通过对20种树脂静态吸附率和解析率的比较，选择南开化工D-101、安徽三星D-1300和天津大钧D-401树脂研究它们的静态吸附动力学特性。准确称取吸干表面水分后的树脂D-101、D-1300和D-401各3g，分别8份，置于250mL三角烧瓶中，各加入pH2.6、浓度为0.141mg·mL-1的花色苷样品液30mL，分别置于水浴摇床(25℃、120r·min-1；30℃、120r·min-1；35℃、120r·min-1)振荡4h，每隔一定时间取出一份，过滤。测定滤液花色苷浓度，记算树脂吸附量，以吸附量对时间作图，绘制静态吸附动力学曲线。

4 吸附等温线的绘制 ○

准确称取吸干表面水分的D-101、D-1300、D-401树脂3.0g，各8份，分别置于250mL三角烧瓶中，加入pH2.6、浓度为 0.282mg·mL-1、0.235mg·mL-1、0.201mg·mL-1、0.176mg·mL-1、0.157mg·mL-1、0.141mg·mL-1、0.094mg·mL-1和0.07mg·mL-1的牡丹花样品液30mL，置于水浴摇床（25℃、120r·min-1；30℃、120r·min-1；35℃、120r·min-1 ）振荡12h，待吸附平衡后测溶液的平衡浓度，并计算吸附量。以平衡吸附量对平衡浓度作图，绘制吸附等温曲线。

5 乙醇浓度的选择 ○

准确称取吸干表面水分的D-1300树脂3.0g，10份，分别置于250mL三角烧瓶中，加入花色苷浓度为0.141mg·mL-1的牡丹花提取液各30mL，置于水浴摇床（25℃、120r·min-1）振荡12h，计算达到吸附平衡时的吸附率。抽干树脂中的滤液，并用蒸馏水冲洗3次，洗去表面附着的花色苷，把吸附后的树脂重新置于三角烧瓶中，分别加入浓度为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、

33

第4章 大孔吸附树脂法纯化牡丹花色苷工艺研究

70％、80％、90％乙醇溶液，置于摇床（25℃、120r·min-1）振荡12h，计算解析率，绘制静态解吸曲线，并计算不同浓度乙醇解析后解析液中花色苷的纯度。

(5) 动态吸附与解吸实验

1 上样浓度对花色苷穿透曲线的影响 ○

综合静态吸附的结果最终确定安徽三星D-1300树脂为花色苷吸附的最优树脂。经过处理的D-1300树脂湿法装柱（Φ1.6cm×20cm），分别将pH2.6、浓度C0为0.282mg·mL-1、 0.201mg·mL-1、0.167mg·mL-1和0.141mg·mL-1的花色苷样品液上柱，上样流速为2BV·h-1。每隔一定时间取流出液测定吸光值，并计算出花色苷浓度C，以C/C0作图对流出时间作图，得到不同上样浓度下花色苷的穿透曲线。

② 上样流速对花色苷穿透曲线的影响

经过预处理的D-1300树脂湿法装柱（Φ1.6cm×20cm），将pH2.6、浓度C0

为0.141mg·mL-1的花色苷样品液分别以流速1、2、3和4BV·h-1上样，每隔一定时间取出流出液测定吸光值，计算出花色苷浓度C。以C/C0对流出时间作图，得到不同上样流速下花色苷的穿透曲线。

③ 乙醇浓度对花色苷洗脱曲线的影响

室温下，D-1300树脂床吸附饱和后，以4倍床层体积蒸馏水洗柱，除去床层空隙中游离的花色苷及部分杂质，然后分别以20%、40%、60%和80%乙醇为洗脱剂以2BV·h-1流速进行洗脱，定时测定流出液的吸光值，计算花色苷的浓度，以花色苷的浓度对洗脱体积作图得到不同浓度洗脱剂的动态洗脱曲线。

4 洗脱剂流速对花色苷洗脱曲线的影响 ○

室温下吸附饱和处理后的D-1300树脂床，60％乙醇分别以1、2、3和4 BV·h-1流速进行洗脱，定时测定流出液吸光值，计算花色苷浓度，以花色苷浓度对洗脱体积作图得动态洗脱曲线，求出最佳洗脱剂流速。

4.3 结果与讨论

4.3.1 树脂静态吸附实验结果

(1) 大孔吸附树脂筛选结果

用20种树脂对牡丹花色苷提取液进行吸附和解吸实验，结果如表4-3所示。从表中可以看出，沧州宝恩ADS-17树脂吸附率最低为35.11％，解析率也很低为56.52％；吸附率达到75％以上的树脂有西安蓝深LS-303(90.46％)、西安

34

河南科技大学硕士学位论文

蓝深LS-45(82.55%)、沧州宝恩HPD-400(78.72%)、天津大钧D-101(87.81%)、南开化工D-101(77.65%)、天津大钧D-401(77.75%)和安徽三星D-1300(82.73%)，它们的解析率依次为56.22％、75.50％、71.64％、71.08％、86.21％、80.52％和81.36％。综合考虑吸附率和解析率结果，选择吸附率和解吸率均较高的南开化工D-101、天津大钧D-401和安徽三星D-1300三种树脂，进一步研究它们的静态吸附动力学曲线和吸附等温线。

表4-3 不同树脂对牡丹花提取液的静态吸附及解吸性能比较

Table 4-3 Comparsions of static adsorption and desorption performance of different resins

树脂名称 南开化工NKA-9 西安蓝深LS-45 天津大均D-201 南开化工D-4020 沧州宝恩HPD-600 安徽三星D-1300 沧州宝恩DM130 西安蓝深LSA-10 沧州宝恩HPD-400 天津大均D-301 Amberlite XAD-7 南开化工D-101 西安蓝深LSA-40 沧州宝恩AB-8 天津大钧D-101 西安蓝深LS-303 天津大钧D-401 安徽三星X-5

沧州宝恩HPD-826 沧州宝恩ADS-17

吸附量(mg·g-1) 吸附率(%) 解析量(mg·g-1)

0.8043

1.3567 0.8711 1.1412 0.8104 1.3597 1.0107 1.1776 1.2520 1.0061 1.1230 1.2763 1.0335 1.1852 1.4432 1.4386 1.2778 1.1412 1.0031 0.5585

50.57 82.55 54.77 71.76 50.95 82.73 63.55 74.05 78.72 63.26 68.33 77.65 64.98 74.52 87.81 90.46 77.75 71.76 63.07 35.11

0.7679 1.0244 0.7694 0.6784 0.7679 1.1063 0.8392 0.8832 0.8969 0.6146 1.0001 1.1002 0.7846 0.8711 1.0259 0.8089 1.0290 0.9439 0.8620 0.3157

解析率(%) 88.11 75.50 88.33 59.44 94.76 81.36 83.03 75.00 71.64 61.09 89.05 86.21 75.92 73.50 71.08 56.22 80.52 82.71 85.93 56.52

(2) 上样溶液pH值的确定

pH值依次为2.2、2.6、3、3.4、4、4.4、5、6的缓冲液把牡丹花提取液稀释至0.141mg·mL-1，分别研究南开化工D-101、天津大钧D-401和安徽三星D-1300树脂的吸附效果，以吸附率对pH值作图（图4-1）。从图中可以看出，D-101树脂，pH值4.4时吸附率最低，为68.87％，pH值2.6时吸附率最高，为75.94％；D-401树脂，pH值5.0时吸附率最低，为68.08％，pH值2.6时吸附率最高为77.02％；D-1300树脂，pH值6.0时吸附率最低为68.79％，pH值2.6时吸附率最高为82.50％。综上所述，因此选择pH值2.6的缓冲液稀释牡丹花提取

35

第4章 大孔吸附树脂法纯化牡丹花色苷工艺研究

液，作为后续研究中上样溶液的pH值。

(3) 三种树脂的静态吸附动力学过程

吸附过程的动力学研究主要是用来描述吸附剂吸附溶质的速率，吸附速率控制了在固-液界面上吸附质的滞留时间[72]。温度、初始浓度、振荡速度等诸多外

85D-10180D-401D-1300吸附率(%)7570652.22.633.4pH44.456图 4-1 上样溶液pH值对树脂吸附率的影响

Fig. 4-1 The effect of the pH value of sample on the adsorption rate of macroporous adsorption

resin

界因素对吸附过程均有不同程度的影响[73]。本章研究了在不同温度条件下D-101、D-1300和D-401三种树脂对牡丹花提取液的吸附量随时间变化的动力学曲线，见图4-2。从图4-2可知，吸附初期，花色苷的吸附速率较大，可以称之为快速吸附过程（第一阶段），此阶段约40min；此后，随时间的延长吸附速率逐渐减小，为慢速吸附过程（第二阶段），此阶段为40-120min，120min后吸附过程基本趋于平衡。从分析结果上看三种树脂的吸附都为快速平衡型[74]（见表4-4）。同时，可以看出，在25℃和30℃时吸附量比较接近，但是在35℃时三种树脂的吸附量明显降低。而且在相同条件下，均是D-1300树脂的吸附量最高。

将吸附过程与各动力学模型进行拟合，确定吸附模型，可对吸附过程进行一定程度的预测。吸附传质速率方程主要有：一级吸附速率方程、二级动力学方程

[75]

、液膜扩散方程[76]及颗粒内扩散方程[77]等。 一级动力学吸附方程：

log(Qe?Qt)?logQe?二级动力学吸附方程：

K1?t (式4-7) 2.30336

河南科技大学硕士学位论文

t1t (式4-8) ??QtK2Qe2Qe1.61.20.8D-10125℃吸附量(mg.g-1)0.40050100150时间(min)D-1300D-401200250

1.630℃吸附量(mg.g-1)1.20.8D-101D-1300D-4010.40050100150时间(min)200250

D-101D-1300D-4011.635℃吸附量(mg.g-1)1.20.80.40050100150时间(min)200250图4-2 花色苷在三种树脂上的吸附动力学

Fig. 4-2 Adsorption kinetic curve of glabridin on three macroporous adsorbent resin

液膜扩散模型：

当吸附过程为液膜扩散模型控制时，t与In(1-Qt/Qe)成直线关系，并通过坐标原点，模型方程为：

?In(1?F)?K3t (F=Qt/Qe) (式4-9)

37

第4章 大孔吸附树脂法纯化牡丹花色苷工艺研究

颗粒内扩散模型：

Kannan等采用如下公式对颗粒内扩散过程进行描述[78]，当吸附过程为颗粒内扩散控制时，t1/2应与Qt成直线关系。

Qt?Kpt0.5?C (式4-10)

式4-7~式4-10中，K1为一级速率常数(min)，t为吸附时间(min)，Qt和Qe 分别为t时刻和达到平衡时花色苷在树脂上的吸附量(mg·g-1)；K2为二级速率常数(min-1)；Kp为内扩散速率常数，C为常数。

表4-4 三种树脂静态吸附花色苷的动力学参数

Table 4-4 Kinetic parameters for the adsorption of anthocyanins on three macroporous adsorbent

resin

动力学参数

动力学模型 树脂 温度 吸附方程 K1 Qe R2

(min-1) (mg·g-1)

298 Qt=1.172(1-e-0.058t) 0.058 1.172 0.827

D-101 303 Qt =1.092(1-e-0.057t) 0.057 1.092 0.863

-0.028t

308 Qt =0.398(1-e) 0.028 0.398 0.835

-0.044t

298 Qt =1.266(1-e) 0.044 1.266 0.954

-0.035t

一级动力学方程 D-1300 303 Qt =1.277(1-e) 0.035 1.277 0.932

308 Qt =1.470(1-e-0.026t) 0.026 0.470 0.994

-0.069t

298 Qt =1.128(1-e) 0.069 1.128 0.964

-0.067t

D-401 303 Qt =1.139(1-e) 0.067 1.139 0.795

-0.054t

308 Qt =0.393(1-e) 0.054 0.393 0.888

K2 Qe R2

(g/mg·min) (mg·g-1)

298 t/Qt =0.744t +11.33 0.049 1.344 0.998

D-101 303 t/Qt =0.807t +11.737 0.056 1.239 0.999

308 t/Qt =1.970t +78.867 0.049 0.508 0.980 298 t/Qt =0.693t +12.597 0.038 1.443 1.000

二级动力学方程 D-1300 303 t/Qt =0.666t +16.662 0.027 1.501 0.999

308 t/Qt =1.849t +56.181 0.061 0.541 0.995 298 t/Qt =0.816t +7.823 0.085 1.225 1.000

D-401 303 t/Qt =0.771t +10.281 0.058 1.297 0.998

308 t/Qt =2.281t +31.173 0.167 0.438 0.999

-1

Kp(min) C R2 298 Qt=0.051t 0.5+0.579 0.051 0.579 0.865

0.5

D-101 303 Qt=0.046t+0.546 0.046 0.546 0.872

308 Qt=0.025t 0.5+0.087 0.025 0.087 0.908

0.5

298 Qt=0.062t+0.511 0.062 0.511 0.848

0.5

颗粒内扩散模型 D-1300 303 Qt=0.070t+0.405 0.070 0.405 0.908

0.5

308 Qt=0.028t+0.098 0.028 0.098 0.850 298 Qt=0.040t 0.5+0.654 0.040 0.654 0.721

0.5

D-401 303 Qt=0.045t+0.623 0.045 0.623 0.880

0.5

308 Qt=0.017t+0.188 0.017 0.188 0.785

38

河南科技大学硕士学位论文

为了确定花色苷在三种树脂上的吸附动力学行为，本实验将不同温度下吸附过程的实验数据与这些动力学模型进行了拟合，模型的动力学参数及相关系数参数 见表4-4。从表中可知，一级反应拟合模型和颗粒内扩散模型的拟合相关系数大部分都小于0.9，拟合效果比较差。而二级吸附动力学模型拟合最好，相关系数大于0.99，因此二级吸附动力学方程更适合描述花色苷在三种树脂上的吸附动力学规律。而相同情况下，D-1300树脂的平衡吸附量Qe均比较大。

一般认为吸附过程包括三个阶段，即液膜扩散、颗粒内扩散及吸附反应，整个吸附过程可能一步或多步控制。一般来说吸附反应较快，不会成为吸附的控制步骤，主要的控制步骤为液膜扩散或颗粒内扩散[79]。本实验中液膜扩散模型的拟合较差，而颗粒内扩散模型拟合结果显示Qt与t0.5不完全是直线关系，表明吸附不仅仅是颗粒内扩散的结果，很有可能是与液膜扩散共同控制的结果。

(4) 三种树脂吸附等温线的测定

实验测定了298K、303K和308K下三种树脂对花色苷的吸附等温线(见图4-3)，由图4-3可知，在低浓度范围内，吸附量随花色苷浓度增加而增加，在较高浓度时吸附趋于平衡，表明树脂与花色苷在低浓度时有较强的亲和力，属于优惠型吸附[80]。当花色苷的浓度较低时，三种树脂吸附量有较高的水平，保证花色苷具有较高的回收率。它们吸附量在35℃时均低于25℃和30℃的值，说明在低温时有利于吸附，而高温则作用相反。

吸附剂在液相中进行吸附时， 实质上是溶剂与被吸附组分对吸附剂的“ 竞争” ，当溶剂的吸附作用可以忽略时， 则吸附体系可按单组分吸附来处理[81] 。固体吸附剂对溶液中有关组分的吸附常见的吸附等温线有二种类型：

单分子层吸附等温线，基于单分子层吸附理论，称为Langmuir方程：

CC1?e (式4-11) e?QeKLQmQm

指数型的吸附等温线，为半经验式，也称为Freundlich方程式：

Qe?KFCen (式4-12)

其线性化形式为：InQe＝nInCe+InKF (式4-13) 式中，Qe为平衡吸附量(mg·g-1)，Ce为平衡浓度(mg·mL-1)，Qm为饱和吸附量(mg·g-1)，KL为结合常数(L·mg-1)；KF、n为等温线特征常数，KL可以评价吸附量的大小，n可描述等温线的变化趋势。

将三种树脂的吸附等温线数据用Langmuir方程和Freundlich线性方程拟合，分别得到相应的回归方程及其参数(见表4-5)。从线性回归结果可以看出，

39

第4章 大孔吸附树脂法纯化牡丹花色苷工艺研究

21.525℃Qe(mg.g-1)10.5000.020.040.060.080.1D-101D-1300D-4010.120.14Ce(mg.mL-1)21.5

30℃Qe(mg.g-1)1D-1010.5000.050.1Ce(mg.mL-1)D-1300D-4010.150.2

21.5Qe(mg.g-1)35℃1D-1010.5000.050.1Ce(mg.mL-1)D-1300D-4010.150.2图4-3树脂吸附花色苷的吸附等温线

Fig. 4-3 Adsorption isotherm curve of anthocyanins on macroporous adsorbent resins

Langmuir模型比Freundlich模型能够更好的描述牡丹花色苷在三种树脂上的吸附平衡过程，相关系数均大于0.98。根据Langmuir等温吸附模型的假定，

40

河南科技大学硕士学位论文

可以初步推测三种树脂对花色苷的吸附呈单分子层吸附。Freundlich模型的等温吸附特征常数n值介于0.1～0.5之间，为“优惠型吸附”[82]，说明了花色苷在这三种树脂上的吸附容易实现。通过测定树脂的吸附等温线，可以大致了解树脂与花色苷之间的相互作用，并对后面的吸附实验有指导作用。同样，在相同条件下，Langmuir模型中树脂D-1300的Qm比另外两种树脂的要大，而在Freundlich模型中树脂D-1300的KF值也比另外两种树脂要大，因此选择树脂D-1300进行后续的实验。

表4-5 三种树脂吸附花色苷的吸附等温线模型参数

Table 4-5 Regression equation and model parameters of isotherm curves for the adsorption of

anthocyanins on three macroporous adsorbent resins

模型参数

等温线模型 树脂 温度 回归模型 -1R2 KL(mL·mg) Qm(mg·g-1)

298 Ce/Qe=0.670Ce+0.010 67.000 1.493 0.996

D-101 303 Ce/Qe=0.712Ce+0.009 79.139 1.404 0.996

308 Ce/Qe=0.803Ce+0.006 138.313 1.205 0.988 298 Ce/Qe=0.699Ce+0.009 77.646 1.431 0.998

Langmuir D-401 303 Ce/Qe=0.774Ce+0.005 154.799 1.292 0.988

308 Ce/Qe=0.665Ce+0.011 60.445 1.504 0.995 298 Ce/Qe=0.582Ce+0.006 97.012 1.718 0.991

D-1300 303 Ce/Qe=0.695Ce+0.005 138.985 1.439 0.987

308 Ce/Qe=0.618Ce+0.009 68.672 1.618 0.995

-1

KF(mL·mg) n R2 298 InQe=0.273Ce+0.873 2.394 0.273 0.930

D-101 303 InQe=0.276Ce+0.873 2.394 0.276 0.936

308 InQe=0.264Ce+0.764 2.147 0.264 0.838 298 InQe=0.280Ce+0.912 2.489 0.280 0.933

Freundlich D-401 303 InQe=0.247Ce+0.801 2.228 0.247 0.822

308 InQe=0.304Ce+0.961 2.614 0.304 0.984 298 InQe=0.305Ce+1.209 3.350 0.305 0.904

D-1300 303 InQe=0.257Ce+0.942 2.565 0.257 0.865

308 InQe=0.322Ce+1.112 3.040 0.322 0.956

(5) 乙醇浓度的选择

分别测定了蒸馏水和乙醇浓度为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％的洗脱剂的洗脱效果（见图4-4）。图4-4显示在乙醇浓度小于40％时，随着乙醇浓度的增加，解析量也逐渐变大。而当乙醇浓度大于50％后，解析量的变化不再明显。同时测定了不同浓度乙醇洗脱液中花色苷纯度，分别为0.02％、3.04％、5.98％、8.54％、11.69％、13.43％、19.25％、18.03％、17.50％和15.41％。可以知道乙醇浓度60％时，洗脱夜中花色苷纯度最高为19.25％。

41

第4章 大孔吸附树脂法纯化牡丹花色苷工艺研究

0.90.80.70.60.50.40.30.20.100 0@P`p??%乙醇浓度(%)解析量(mg.g-1)图4-4 不同乙醇浓度的洗脱曲线

Fig. 4-4 The elution curve of different concentrations of ethanol

4.3.2 大孔吸附树脂D-1300动态吸附和解吸实验结果

（1） D-1300树脂动态吸附牡丹花色苷特性的研究

流速为2BV/h，温度为室温，分别将浓度为 0.282mg·mL-1、0.201mg·mL-1、0.167mg·mL-1和0.141mg·mL-1的花色苷样品上样，测定吸附后流出液中花色苷

1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10.0-0.100.282mg/mL0.201mg/mL0.167mg/mL0.141mg/mLC/C050100150200250300350时间(min)图4-5上样浓度对花色苷穿透曲线的影响

Fig. 4-5 Effect of concentration of anthocyanins on its breakthrough curves

浓度，绘制穿透曲线，研究花色苷浓度对树脂动态吸附动力学曲线的影响。由图4-5可以看出，样品花色苷浓度越高，漏点(C0/10)就出现的越早，随上样浓度由大到小，穿透时间分别为：70min，105min，120min和174min，达到泄漏点时树脂吸附花色苷的量分别为19.740mg，21.105mg，20.040mg和24.534mg，因

42

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/0ajw.html