间接荧光法测水果的抗氧化活性

罗丹明6G-Mn2+-H2O2体系荧光分光光度法

测定水果的抗氧化活性

1 前 言

羟自由基(·OH)是活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基。它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变。羟自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关。对机体适当补充外源性抗氧化剂或给予能促使机体内源性物质恢复到一定水平的药物，可改善这些状况。由于长期使用化学合成的抗氧化剂对人体有一定的副作用，所以，寻找天然、安全、无毒的抗氧化剂就越来越受到人们的重视。

对羟自由基的研究有许多，例如：荧光法研究高粱红色素清除羟自由基活性，为高粱红色素的合理开发和利用提供了一定的参考依据；罗丹明6G-Co2+-H2O2体系荧光法测定常见蔬菜的抗氧化活性，测定了14种常见的蔬菜的抗氧化活性，其中菠菜、油菜、韭菜、香菜、雪里蕻5种绿叶蔬菜的抗氧化活性较强；

目前，离体检测羟自由基的方法主要有电子自旋共振（ESR）法[1]、化学发光法[2]、光度法[3]及荧光法[4]，这些方法多是用传统的Fe2+-H2O2体系产生羟自由基，或Cu+、Co2+、代替Fe2+[5、6]使灵敏度提高，对水果抗氧化活性的研究已有报道[7]。本文采用同步荧光法[8]和普通荧光法绘制荧光谱图，进行谱图比较，根据前人做过的试验预测采用同步荧光法比普通荧光法的灵敏度高，有效减少光谱干扰，用罗丹明6G作指示剂，在Mn2+-H2O2体系产生羟自由基(·OH)，测定水果的抗氧化活性。从常见水果中寻找抗氧化剂，充分利用丰富的水果资源，具有实际意义。 2 测定原理

传统的Fenton反应是用Fe2+-H2O2体系产生羟自由基。本文研究发现，Mn2+亦可与H2O2作用，类似Fenton反应产生羟自由基，产率比FeSO4还要高，其反应原理可类推如下:

Mn2++H 2O2→Mn(Ⅲ)+·OH+ OH- Mn(Ⅲ)十H2O2→Mn(IV)+·OH + OH-

然后，利用羟自由基迅速氧化罗丹明6G，使罗丹明6G的荧光强度显著降低，降低程度随羟自由基的增加而加大，从而间接测定羟自由基的产生量。而水果提取物可以部分清除溶液中的羟自由基，从而使其荧光碎灭程度减弱，据此可以测定水果抗氧化性。 3 实验部分

1

3.1 主要仪器与试剂 3.1.1 主要仪器

WGY-10型分子荧光分光光度计 天津港东科技发展有限公司 SQ2119多功能食品加工机 上海帅佳电子科技有限公司 TD4台式离心机 湖南仪器表总厂离心机长 电子分析天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司 PHSJ-3F实验室pH计 上海精密科学仪器有限公司 3.1.2 主要试剂

MnSO4·H2O（含量不少于99%） 天津市北方天医化学试剂厂 抗坏血酸（含量不少于99.7%） 天津市福晨化学试剂厂 H2O2（含量不少于30%） 天津市凯通化学试剂有限公司 罗丹明6G 天津市津科精细化工研究所 氯化铵（含量不少于99.5%） 天津市津东天正精细化学试剂厂 氨水(含量不少于25%-28%) 天津市赢达希贵化学试剂厂 所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。 3.2 储备液的配制

干燥的小烧杯若干，1L容量瓶1只，100 mL容量瓶3只，1000 mL的容量瓶，塑料瓶，500mL容量瓶两只，50mL容量瓶5只，10mL容量瓶20只。2mL移液管4只，贴上标签(罗丹明6G，Mn2＋，H2O2，buffer。)，100ml量桶（H2O2），10mL移液管3只（缓冲） 3.2.1 硫酸锰储备液的配制

准确称取MnSO4·H2O0.3397g，在小烧杯中用少量水溶解转移100 mL容量瓶中定容，配制成20 mmol/L溶液作为储备液。实验所用的浓度是2 mmol/L，移取10mL20 mmol/L储备液于100 mL的容量瓶中定容至刻度。 3.2.2 罗丹明6G储备液的配制

准确称取罗丹明6G 0.01 g，在小烧杯中溶解，转移定容在1000 mL的容量瓶中，配成1×10-2 g/L的储备液。 3.2.3 1%双氧水储备液的配制

准确移取30% H2O23 mL于聚乙烯的塑料瓶中，再加87 mL的蒸馏水。 3.2.4 氨水储备液的配制

准确移取3.33 mL浓氨水，稀释至500 mL的容量瓶中，定容至刻度，配制成0.1

2

mol/LNH3·H2O的储备液。 3.2.5 氯化铵储备液的配制

准确称取2.6855 g氯化铵，在小烧杯中用少量水溶解，转移定容在500 mL的容量瓶中，配制成0.1004 mol/LNH4Cl的储备液。

3.2.6 根据化学手册配制成不同pH值0.1mol/LNH3·H2O-0.1004mol/LNH4Cl的缓冲溶液：

NH4Cl V/mL NH3·H2O V/mL

pH

32

32

30

25

15

1 8.0

4 8.58

15 9.1

25 9.5

30 9.8

10mL移液管，配于50mL容量瓶中，注意不要定容！ 3.2.7 抗坏血酸储备液的配制

准确称取抗坏血酸0.3523 g，在小烧杯中用少量水溶解，转移定容在100 mL的容量瓶中，得到20 mmol/L的储备液。实验时，移取2.5 mL20 mmol/L的抗坏血酸，转移定容在100 mL的容量瓶中得到0.5 mmol/L的抗坏血酸。 3.3 实验方法 3.3.1 羟自由基的测定

在10 mL容量瓶中，pH 9.5的缓冲溶液1.0 mL，加入1Χ10-2 g/L的罗丹明6G 1.6 mL， 2.0 mmol/L的Mn2+ 溶液 1 mL，1%的H202溶液 0.8 mL，加蒸馏水至刻度，混匀。测定 542 nm波长处的荧光强度F，计算其与空白参比(罗丹明6G与缓冲液)荧光强度F0之差△F，通过测定·OH形成前后罗丹明6G的荧光强度变化，来反映·OH的产生量。 3.3.2 羟自由基清除率的测定

在上述体系中加入一定量的羟自由基清除剂，同样操作侧定荧光强度Fs；罗丹明6G和缓冲溶液作为空白体系，其荧光强度为F0，未加清除剂的体系，其荧光强度为F，则清除率=(Fs-F)/(F0-F)×100%

3.3.3 水果水提取物清除·OH的作用

新鲜水果洗净，晾干，准确称取40 g，加入200 mL蒸馏水，匀浆3 min，过滤，离心5 min，取上层清液0.6mL按上述方法进行测定。 4 结果与讨论

3

4.1.荧光光谱

罗丹明6G本身能产生特征荧光，其激发波长和发射波长分别为 350 nm和 542 nm，

图1 同步荧光分光光度法测得的荧光光谱

1、罗丹明6G +缓冲溶液

2、罗丹明6G +缓冲溶液+Mn2++H2O2+水果提取物 3、罗丹明6G +缓冲溶液+Mn2++H2O2

4.2 实验参数

工作模式：发射扫描 扫描间隔：2 nm 激发狭缝: 6 nm 发射狭缝：6 nm 负高压：130 V 4.3 实验条件

实验条件对羟自由基的产生有影响，也对抗氧化剂对羟自由基的清除率有影响，应综合考虑这两方面的因素，选择适宜的测定条件。 4.3.1 酸度的影响

空白和羟自由基体系的△F受pH值的影响如图2所示。可以看出，在------范围内，△F有较大值，故选用弱碱性介质pH―――――的缓冲溶液。（注意溶液加入顺序）

序号 缓冲各1mL(pH=) 罗丹明6G(1Χ10-2 g/L) /mL Mn2+(2.0 mmol/L )/mL H2O2(1%)/mL

① 8.0 1 1 0.8 4

② 8.58 1 1 0.8 ③ 9.1 1 1 0.8 ④ 9.5 1 1 0.8 ⑤ 9.8 1 1 0.8

缓冲各1mL(pH=) 罗丹明6G(1Χ10-2 g/L) /mL

4.3.2 罗丹明6G的用量

1’ 8.0 1 2’ 8.58 1 3’ 9.1 1 4’ 9.5 1 5’ 9.8 1 加入不同体积1Χ10-2 g/L罗丹明6G溶液，按试验方法测定空白体系和·OH体系的△F，如图3所示，结果表明罗丹明6G用量为-------- mL。

缓冲 (pH=y )/mL 罗丹明6G(1Χ10-2 g/L) /mL Mn2+(2.0 mmol/L )/mL H2O2(1%)/mL 缓冲 (pH= y )/mL 罗丹明6G(1Χ10-2 g/L)/mL 0.6 4.3.3 硫酸锰的用量

按实验方法加入不同体积2 mmol/L的MnSO4溶液，测定荧光强度，选用MnSO4溶液为--------------- mL。

缓冲 (pH=y )/mL 罗丹明6G(1Χ10-2 g/L) /mL Mn2+(2.0 mmol/L )/mL H2O2(1%)/mL

① 1 0.6 ② 1 0.8 ③ 1 1 ④ 1 1.4 ⑤ 1 1.6 1 0.8 1’ 1 1 0.8 2’ 1 0.8 1 0.8 3’ 1 1 1 0.8 4’ 1 1.4 1 0.8 5’ 1 1.6 ① 1 1.6 ② 1 1.6 ③ 1 1.6 ④ 1 1.6 ⑤ 1 1.6 0.8 0.8 1’ 1 0.8 1.2 0.8 1.6 0.8 2 0.8 5

缓冲 (pH=y )/mL 罗丹明6G(1Χ10-2 g/L) /mL 4.3.4 过氧化氢的用量

1.6 1 用不同体积1%的H2O2按试验方法测定荧光强度，本实验选用H2O2溶液

缓冲 (pH=y )/mL 罗丹明6G(1Χ10-2 g/L) /mL Mn2+(2.0 mmol/L )/mL H2O2(1%)/mL 缓冲 (pH= y )/mL 罗丹明6G(1Χ10-2 g/L) /mL 4.5 抗氧化剂清除羟自由基作用的测定

于体系中加入抗坏血酸，按试验方法测定空白体系的F0，·OH体系的F，加清除剂体系的Fs。荧光强度变化如图1所示，结果表明，随抗坏血酸用量增加，清除率加大。说明本体系中抗坏血酸与·OH的清除作用有明显的量效关系。 4.6 水果的抗氧化作用

测定了3种新鲜水果的水提取物对·OH的清除率，结果见表2。从表中看出，具有较强的清除·OH的功能。

F0=70.1 F=26.7

表2各种水果的清除率

水果 西红柿 梨 橙子

① 1 1.6 ② 1 1.6 ③ 1 1.6 ④ 1 1.6 ⑤ 1 1.6 2 0.3 1’ 1 1.6 2 0.5 2 0.8 2 1.0 2 1.4 Fs 64.7 27.5 55.9 6

清除率（%） 87.56 1.84 67.28

5 结果讨论

从这次实验中可以看出水果盘蔬菜中含有大量天然抗氧化剂、 且提取率高、 抗氧化活性强，其与机体亲和力强和安全性高等优点具有取代合成抗氧化剂趋势， 是今后的研究重点。另外， 天然抗氧化剂尚需在有效成分的抗氧化机理、 协同作用、 构效关系和分子设计等方面开展深入研究， 为天然植物开发抗氧化剂的应用奠定理论基础； 同时要加强天然植物原料提取、 分离纯化有效成分工艺研究， 以尽快实现天然抗氧化剂的产业化。

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本科生设计实验论文

题

目：罗丹明 学生姓名：导师姓名： 院 别： 系 别： 专 业： 年 级： 学 号：6G-Mn2+

-H2O2体系荧光分光光度

法测定水果的抗氧化活性

兰瑞家

化学与材料科学学院 化 学 应用化学 2011届毕业生 070602420

完成日期 2010年12月5日8

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/05hr.html