灵芝多糖对小鼠体液免疫功能的影响

第24卷第2期暨南大学学报(医学版) Vol.24No.2 2003年4月 JournalofJinanUniversity(MedicineEdition) Apr.2003

灵芝多糖对小鼠体液免疫功能的影响

江振友, 林 晨, 刘小澄, 韦 静, 袁桂秀, 李小兰

(暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室,广东广州510632)

[摘 要] 目的:研究灵芝多糖(GLB7)对小鼠特异性体液免疫功能调节的影响。方法:实验小鼠分成4组,分别经胃灌注不同剂量灵芝多糖,每天1次,连续14d,对照组小鼠用等量蒸馏水代替。在实验第10、24d用羊红细胞(SRBC)免疫小鼠,分别于免疫后第5d进行抗体生成细胞(AFC)检测和血清抗SRBC抗体凝集效价测定。结果:灵芝多糖喂药后2周,高、中、低3个剂量组小鼠抗体生成细胞以及高剂量组小鼠血清溶血素(抗体积数)与对照组比较均有显著性差异(P<0 01;P<0 05);喂药后4周,高、中、低3个剂量组小鼠抗体生成细胞以及小鼠血清溶血素(抗体积数)与对照组比较均无显著性差异(P>0 05)。结论:灵芝多糖能提高小鼠的B细胞产生特异性抗体的能力。

[关键词] 灵芝; 体液免疫功能; 灵芝多糖; 抗体生成细胞

[中图分类号] R979.5 [文献标识码] B [文章编号] 1000-9965(2003)02-0051-03

现代药理研究发现,灵芝含有10余种氨基酸、20多种酶、多种蛋白质、有机酸、糖类及多种微量元素,具有多种生理、药理作用。灵芝多糖(ganodermalucidumpolysacchrides)系灵芝[GanodermaLucidum(Leyss ExFr.)Karst]的主要有效成分。灵芝多糖具有免疫增强和抗肿瘤作用[1,2]。本研究旨在整体条件下观察灵芝多糖(GLB7)对NIH小鼠产生抗-羊红细胞(SRBC)抗体能力的影响,以探讨灵芝多糖对小鼠体液免疫功能的调节作用,为灵芝的滋补强壮、扶正固本作用提供免疫学实验依据。

1 材料与方法

1 1 主要药品试剂、仪器

化学灵芝多糖GLB7,按文献[3,4]方法提取,化学组成是以葡萄糖、半乳糖为主的杂多糖,糖苷键连接方式以 (1 4)为主,稍多 (1 6),相对分子质量9000;RPMIl640细胞培养液为Hyclone产品,小牛血清为Gibco公司产品。721分光光度计、离心机、恒温水浴箱、SRBC、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液。

1 2 实验动物

NIH小鼠,雌雄随机,每只(20 2)g,广东省医学实验动物中心提供。

1 3 实验方法

(1)分组与处理 小鼠随机分为4组,每组30只。即正常对照组(CK)、灵芝多糖高剂量组(HD)、中剂量组(MD)和低剂量组(LD);用蒸馏水溶解稀释灵芝多糖(受试物),每组小鼠均灌胃0 5mL/只。高、中、低剂量组小鼠灌胃灵芝多糖剂量分别为2 15、0 65、0 22mg/只;CK组同时以蒸馏水灌胃0 5mL/只。每日1次,连续2周,于15d每组取20只小鼠进行免疫功能调节作用测试,其余10只动物于第15d起停止给予受试物,正常喂养至第28d进行免疫功能测试。

(2)抗体生成细胞(antibodyformingcell,AFC)检测(定量溶血分光光度测定法,QHS) 新鲜羊血用生理盐水洗涤3次,每次离心(2000r/min)10min,将压积SRBC用生理盐水配成体积分数为2%的细胞悬液,在实验第10、24d分别用SRBC免疫小鼠,每只鼠腹腔注射0 2mLSRBC进行免疫。将SRBC免疫4~5d后的小鼠颈椎脱臼处死取出脾脏,置Hanks液的小平皿内,制成细胞悬液,经200目筛网过滤,离心1000r/min10min,用

[收稿日期] 2002-09-04

[]()男,,.

52暨南大学学报(医学版)2003年Hanks液洗2遍,最后将细胞悬浮在5mLRPMIl640培养液中,计数细胞,并将细胞密度调整为5 106/mL。将脾细胞1mL置试管内,依次加入体积分数为10%SRBC0 5mL,补体1mL(用SA液按1 10稀释)。另设不加细胞的对照管(以SA液代替)。置37 恒温水浴中保温30min后,冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液于721分光光度计波长413nm处,分别测定各管吸光度A值。采用单因素方差分析比较各试验组与对照组的差异。

(3)血清溶血素的测定(血凝法) 新鲜羊血用生理盐水洗涤3次,每次离心2000r/min10min。将压积SRBC用生理盐水配成体积分数为2%的细胞悬液,在实验第10、24d分别用SRBC免疫小鼠,每只鼠腹腔注射0 2mL进行免疫。免疫后4~5d后,摘除眼球取血于离心管内,放置约1h,将凝固血与管壁剥离,使血清充分析出,2000r/min离心10min,收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释,将不同稀释度的血清分别置于微量血凝试验板内,每孔100 L,再加入100 L体积分数为0 5%的SRBC悬液,混匀,装入湿润的平盘内加盖,于37 恒温水浴箱孵育3h,观察血球凝集程度。采用单因素方差分析比较各试验组与对照组的差异。血清凝集程度一般分为5级(0~ )记录,按下式计算抗体积数。

抗体积数=(1S1+2S2+3S3 nSn)

式中1、2、3 n代表对倍稀释的指数,S代表凝集程度的级别,抗体积数越大,表示血清抗体越高。0级:红细胞全部下沉,集中在孔底部形成致密的圆点状,四周液体清皙;

级:红细胞大部分沉集在孔底成圆点状,四周有少量凝集的红细胞;

级:凝集的红细胞在孔底形成薄层,中心可以明显见到一个疏松的红点;

级:凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,中心隐约可见一个小红点;

级:凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,疑块有时成卷折状。

2 实验结果

灵芝多糖喂鼠后2周,高、中、低3个剂量组小鼠抗体生成细胞A值以及高剂量组小鼠血清溶血素(抗体积数)和对照组比较均有显著性差异(P<0 01;P<0 05);灵芝多糖喂鼠后4周,高、中、低3个剂量组小鼠抗体生成细胞A值以及小鼠血清溶血素(抗体积数)和对照组比较均无显著性差异(P>0 05)。见表1,2。

表1 灵芝多糖对小鼠抗体生成细胞的影响

组 别

对照组

高剂量组

中剂量组

低剂量组2周n/只20202020A0.36 0.130.44 0.101)0.56 0.062)0.66 0.132)n/只101010104周A0.49 0.0.53 0.0.52 0.0.44 0.17141706

x s

4周

抗体积数

22.92 12.72

30.35 13.911)

18.43 14.05

16.93 15.36n/只10101010抗体积数19.87 14.9724.92 19.1225.77 16.6526.37 16.32x s 1)与对照组比较,P<O 05;2)与对照组比较,P<0 01表2 灵芝多糖对小鼠血清抗SRBC抗体凝集效价的影响组 别对照组高剂量组中剂量组低剂量组

1)与对照组比较,P<O 052周n/只20202020

3 讨论

,,

第2期江振友等: 灵芝多糖对小鼠体液免疫功能的影响53 喘、滋补强壮、扶正固本等功效。灵芝含有多种有效成分,多糖类是其主要有效成分之一。现代药理研究表明,灵芝具有多方面的生物活性和药理作用。灵芝生理、药理作用的研究已受到国内外学者的重视。灵芝多糖具有抗肿瘤作用,其抗肿瘤作用可能与多糖的免疫增强作用有关。国内外学者从灵芝的子实体和菌丝体中提取出具有抑制动物移植性肿瘤的灵芝多糖,推测其抗肿瘤作用是宿主中介性的,可能与加强机体的免疫功能有关[5,6]。

灵芝子实体提取物能有效地激活吞噬细胞对外来物质的募集和摄取作用,由此增强吞噬作用。其靶细胞包括肝脏枯否氏细胞、脉管内皮细胞、淋巴节中网状细胞。灵芝水煎剂具有对抗环磷酰胺(CP)所致白细胞数量减少作用,能增加胸腺重量和脾脏重量,增加巨噬细胞吞噬功能,并能促进T淋巴细胞转化和溶血素的生成。机体对抗原物质的免疫应答,是由免疫系统中各免疫细胞(包括巨噬细胞、TH细胞和B细胞等)相互协调共同完成的。小鼠血清抗绵羊红细胞(SRBC)抗体产生实验则可作为综合反映或评价机体免疫系统功能的一个客观指标。

本研究发现灵芝多糖喂药后2周,高、中、低3个剂量组小鼠抗体生成细胞、高剂量组小鼠血清溶血素(抗体积数)和对照组比较均有显著性差异,表明灵芝多糖对小鼠的体液免疫功能具有一定的调节作用,并且与其剂量有密切关系。小剂量组小鼠抗体生成细胞增加作用较明显,这种现象可能与免疫系统的自身稳定调节机制有关。许多研究表明:中药多糖对白细胞介素(尤其是IL-1、IL-2)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子有诱生作用。灵芝多糖可明显增加小鼠脾淋巴细胞产生IL-2的能力,还能促进IL-6、TNFmRNA的表达,可在转录水平影响这些细胞因子的产生。雷林生等[8]研究发现灵芝多糖GLB7能通过促进小鼠脾细胞原代培养时IL-1及TNF mRNA的表达从而促进IL-1及TNF 的合成与分泌。IL-1主要由单核巨噬细胞分泌,具有多方面的生理作用,在免疫反应过程中,能刺激T淋巴细胞分泌IL-2并表达其受体,协同IL-2促进LAK细胞的产生,激活NK细胞并诱导杀肿瘤活性。TNF- 是活化巨噬细胞释放的另一细胞因子,不仅能够抗肿瘤,而且对多种免疫和炎症反应的效应细胞都有调节作用。灵芝多糖提高小鼠免疫功能的机制之一可能与灵芝多糖增加小鼠脾淋巴细胞产生IL-1、IL-2、IL-6、TNF的mRNA的表达,在转录水平影响这些细胞因子的产生有关。本研究发现灵芝多糖喂药后4周,小鼠抗体生成细胞、小鼠血清溶血素(抗体积数)和对照组比较均无显著性差异,原因可能为喂药后4周,灵芝多糖GLB7诱生的细胞因子已下降到正常水平。

真菌提取的多糖类物质具有多方面的免疫调节作用,但对其作用机制的研究还须深入探讨,我国药用真菌资源丰富,对其活性成分的研究有助于推动对资源的利用与开发,有助于新药物的筛选。本研究表明,灵芝多糖GLB7能增强小鼠特异性体液免疫功能,在抗肿瘤、抗病毒,及免疫调节等方面有重要作用。为此临床可用该多糖作为改善抑制剂、抗肿瘤药物。[7]

[参考文献]

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mixedlymphocyteresponse[J].ActaPharmaceuticaSinica,1992,27(5):331.

[2] LEILS,LINZB.EffectofGanodermapolysaccharidesontheactivityofDNApolymerase inspleencellsstimulated

byallantigensinmiceinvitro[J].JBeijingMedUniv,1991,23(4):329.

[3] 李荣芷,何云庆.灵芝抗衰老机理与活性成分灵芝多糖的化学与构效研究[J].北京医科大学学报,

1991,23(6):473-475.

[4] 何云庆,李荣芷,陈 琪等.灵芝扶正固本有效成分灵芝多糖的化学研究[J].北京医科大学学报,1989,

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[7] 汤新慧.灵芝水煎剂对小鼠免疫功能的影响[J].中医研究,2000,13(6):8-10.

[8] 雷林生,王庆彪,孙莉莎等.灵芝多糖对小鼠脾细胞白细胞介素1、肿瘤坏死因子的产生及其mRNA表

达的影响[J].中药药理与临床,1998,14(2):16-18.

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