2012细胞工程教学提纲及补充思考题 - 图文

《细胞工程》教学提纲、课后思考题及补充思考题

课程学时：36学时，学分：2学分 ? 教学基本要求：

? 1．了解与细胞工程相关的重要理论，背景知识和细胞工程学的基础知识。

? 2．了解和掌握细胞工程各种技术的基本原理、技术和方法。 ? 3．了解和掌握细胞工程的工程与实验技术。

? 4．了解细胞工程重要技术的应用途径和范围，存在的问题及缺点。 ? 5．了解细胞工程关键技术的最新进展和发展前景。

课程考核方式：

? 闭卷笔试综合考查。平时考查与期末考试相结合。 ? 1、平时出勤、作业成绩占10%； ? 2、期中考试成绩占30%； ? 3、期末考试成绩占60%。

第一章 绪论 第1节 生物工程 ? 1.1 定义 ? 1.2 发展历程

? 1.3 现代生物工程的特点与组成

? 一、定义

? 1、利用生物将原材料转化为产品的技术。（Kail Ereky，1917）

? 2、应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将材料进行加工以提供产品为社会服务的技术。（国际合作及发展组织，1982）

? 3、以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产所需产品或达到某种目的的技术。（国家科委，1986） 生物技术（biotechnology）——以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术，也就是利用生物有机体或其组成部分如细胞、组织、器官等发展新工艺或制造新产品的技术。

? 二、发展历程

? 1、第一代生物工程（微生物发酵，如酒精等） ? 2、近代生物工程（医用抗生素、氨基酸、酶） ? 3、现代生物工程（高新技术） ? 三、现代生物工程的特点与组成 ? 1、发酵工程 ? 2、酶工程 ? 3、蛋白质工程 ? 4、基因工程 ? 5、生物化学工程 ? 6、细胞工程

第2节 细胞工程

? 2.1 定义 ? 2.2 发展历史 ? 2.3 主要研究内容 ? 2.4 重要应用

? 一、定义

? 细胞工程（cell engineering）——应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或特种细胞产品的一门综合性科学技术。 ? 二、发展历史（略） ? 三、主要研究内容 ? 1、动植物细胞与组织培养 ? 2、细胞融合 ? 3、染色体工程 ? 4、胚胎工程 ? 5、细胞遗传工程 ? 四、重要应用

? 1、优质植物快速培育与繁殖

? 2、动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种 ? 3、利用动植物细胞培养生产活性产物、药品 ? 4、新型动植物品种的培育

? 5、供医学器官修复或移植的组织工程

? 6、转基因动植物的生物反应器工程 ? 7、珍稀动植物资源的保存与保护

? 8、应用于遗传学、发育学等领域的理论研究 ? 9、应用于能源开发、环保等

第一章小结：

? 定义 ? 一、生物工程 发展历程

? 现代生物工程的特点与组成 ? 定义 ? 二、细胞工程 发展历史 ? 主要研究内容 ? 重要应用

第二章 细胞工程基础 第1节 细胞生物学基础 ? 1.1 细胞

? 1.2 染色质与染色体 ? 1.3 细胞周期 ? 1.4 细胞分裂

? 1.5 细胞分化与细胞全能性 ? 细胞分化——个体细胞发育过程中，后代细胞在形态结构和生理功能上发生差异的过程。

? 持家基因——细胞中维持细胞生存所必需的基因。 ? 组织专一基因——在各种细胞中专一选择表达的基因。

? 发育潜能——细胞分化能力的强弱。高度分化的植物营养组织具有全能性，高等动物细胞发育潜能变窄。

细胞全能性——已经分化和尚未分化的细胞所具有的表达生物体基因组任何一种基因、分化出任何一种类型细胞、各种组织直至发育成完整个体的潜能。

? 多能性——随着胚胎的发育，细胞具有分化出各种组织的潜能而失去发育成完整个体的潜能，这种发育潜能叫多能性。

? 去分化——在某些条件下，分化细胞不稳定，基因活动模式发生可逆变化又回到未分化状态的过程，如培养条件下的植物愈伤组织。

? 一个已分化细胞，要表现其全能性，形成完整个体，首先要经历脱分化，然后再经历再分化过程。

第2节 分子生物学基础 ? 2.1 基因与基因复制 ? 2.2 转基因技术 第3节 普通生物学基础 ? 3.1 组织、器官 ? 3.2 生殖、发育 ? 一、组织、器官

? 分生组织 ? 植物组织

? 成熟组织 ? 上皮组织 ? 动物组织 结缔组织 ? 肌肉组织 ? 神经组织 ? 分生组织按在植物体中的位置分： ? （1）顶端分生组织 ? （2）侧生分生组织 ? （3）居间分生组织 ? 二、生殖、发育

? 1、高等植物的生殖和发育： ? 花粉粒的形成和发育

? 胚囊的形成和发育 →开花与传粉

? →花粉萌发和双受精作用→受精胚珠发育形成种子（合子发育成胚，受精极核发育成胚乳）→果实形成→种子萌发与幼苗形成 ? 2、高等动物的生殖和发育：

? 受精卵→卵裂球→囊胚→原肠胚→形成中胚层→胚层分化→幼体

? 顶体反应——获能的精子释放顶体酶，溶解卵细胞周围的放射冠和透明带的变化。

? 精子必须穿过几层物理性的屏障才能穿入卵内。在哺乳动物中，精子入卵所面临的第一层屏障是一层包埋在黏性透明质酸中的卵丘细胞。精子头部表面的透明质酶活性有助于精子穿过卵丘细胞层。第

二层屏障是在卵丘细胞层下面包裹卵细胞的一层透明带。

? 卵透明带是被覆于卵母细胞及着床前受精卵外的一层基质，由糖蛋白组成。在受精过程中及早期孕卵发育方面具有重要的作用。 ? 当一个获能的精子进入一个次级卵母细胞的透明带时，受精过程即开始。到卵原核和精原核的染色体融合在一起时，则标志着受精过程的完成。

? 受精的过程包括精子与卵子接触、精子穿过卵细胞的放射冠和透明带、次级卵母细胞进行第二次分裂及两性原核的融合。

精子头部通过顶体反应释放顶体小泡中的内容物，有助于精子穿过透明带。透明带中含有一种特异性结合的糖蛋白受体ZP3，而精子头部含有一种能够和ZP3结合的黏附分子β1，4－半乳糖基转移酶。当精子与ZP3结合后，顶体通过胞吐作用将内容物释放。释放的内容物主要是一些酶类，包括β－N－乙酰葡萄糖胺糖苷酶和顶体素，前者用于降解透明带糖蛋白上的寡糖链，后者为一种蛋白酶。它们可以使精子表面与卵细胞质膜结合的蛋白暴露出来。受精素就是其中的一种，有两个跨膜亚基组成，能与卵细胞质膜上的整联蛋白受体结合，从而引发精子与卵子融合。 ? 胚层的分化 ? （1）外胚层

? 分化成皮肤表皮和其衍生物（比如口腔、鼻腔、肛门的粘膜、毛发、指甲、爪等）、神经系统、感觉器官、肾上腺髓质等。 ? （2）内胚层

? 分化形成消化道、呼吸道及排泄管道的上皮、肝、胰、扁桃体、甲状腺、胸腺等。

? （3）中胚层

? 分化形成肌肉、骨骼、血管和血液、淋巴系统、肾脏、生殖腺、肠系膜等。

第二章小结：

? 一、细胞生物学基础（细胞、染色质与染色体、细胞周期、细胞分裂、细胞分化与细胞全能性）

? 二、分子生物学基础（基因与基因复制、转基因技术） ? 三、普通生物学基础（组织与器官、生殖与发育）

第三章 植物组织与细胞培养

第1节 植物组织培养与细胞培养的区别

? 组织培养——从生物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织的技术。植物组织培养主要是植物无性脱毒快速繁殖技术。

? 细胞培养——使动植物细胞在体外条件下存活或生长的技术，不再形成组织。植物细胞培养主要是以生产植物次生代谢产物为目的的大规模细胞培养技术。

第2节 发展历史（自学） 第3节 植物组织与器官培养 ? 3.1 定义与基本原理 ? 3.2 几个重要概念 ? 3.3 细胞分化和形态建成

? 3.4 植物组培的基本步骤 ? 3.5 愈伤组织培养 ? 3.6 植物器官培养 ? 3.7 植物组培的应用 ? 3.8 人工种子 ? 3.9 植物组织与器官的生物反应器培养

? 一、定义与基本原理

? 植物组织培养——在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整植株的技术。 ? 理论依据：细胞全能性

科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。

? 植物组织培养技术是一种无性快速繁殖技术，与常规营养繁殖方法相比，只需少量材料就能获得大量植株，可以节约大量种子、肥料、耕地，而且是在人工无菌操作和控制生长环境条件下进行，可进行工业化生产，对保质、保纯和反季节生产有着特殊作用，被认为是农业高新技术中最重要、最活跃的领域之一，不仅是农业继续发展的基础，而且是生物技术中应用最广、最具现实意义的领域，被誉为农业发展史上的第四次绿色革命，对解决经济和社会发展所面临的人口增长、农业资源贫乏、环境污染等重大问题具有十分重要的战略意义。 ? 二、几个重要概念

? 1、全能细胞

? 能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能分化出该生物体内任一类型细胞，进而发育为一个完全相同生物体的细胞。如合子（受精卵）、早期胚胎细胞、顶端分生组织细胞、成熟器官遗留的胚性细胞等。 ? 2、愈伤组织

? 由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞，比较容易分离，通常在外植体伤口处产生。这些细胞的大小、形状、液泡化程度、胞质含量、细胞壁特性等通常有较大差异。 ? 继代培养→器官发生→再生植株 ? 单细胞→细胞培养 ? 原生质体 ? 3、外植体

? 植物组培中用来进行离体无菌培养的离体材料，器官、组织、细胞、原生质体都可以。 ? 4、继代培养

? 愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时将这些组织转移到新的培养基上的培养方式，也称传代培养。 ? 三、细胞分化和形态建成

? 体细胞胚——指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物，又叫胚状体。

? 去分化——在某些条件下，分化细胞不稳定，基因活动模式发生可逆

变化又回到未分化状态的过程，如培养条件下的植物愈伤组织。 ? 一个已分化细胞，要表现其全能性，形成完整植株，首先要经历脱分化，然后再经历再分化过程。

? 组培研究结果表明：分化细胞的脱分化关键需要两个条件：创伤和外源激素，如生长素、细胞分裂素或赤霉素。 ? 植物组织培养常用仪器设备：

? 电子天平、高压蒸汽灭菌锅、电热干燥箱、超净台、冰箱、人工气候培养箱、人工气候室、三重纯水蒸馏器、超纯水仪、电炉、试管、三角瓶、培养皿、剂量器皿（量筒、容量瓶、移液管、移液枪等）、烧杯、试剂瓶、镊子、解剖剪、解剖刀等。 ? 植物组织培养培养基成分：

? 培养基应含有植物生长所必需的各种营养成分，以满足植物正常生长发育的需要。在完整的全培养基中应包括无机盐类、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等物质。这些物质主要有四个方面的生理作用：一、作为结构物质参与机体的建构，如蔗糖提供碳源，肌醇在糖类的相互转化中起作用，是构成细胞壁的材料，也参与细胞膜的构建。氨基酸是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用；二、构成特殊的生理活性物质，在代谢中起调节作用，如维生素类物质在植物细胞中主要以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长有促进作用；三、维持离子浓度的平衡、电荷平衡、胶体平衡等，如琼脂作为培养组织的支撑物起支持作用；四、影响器官的形态发生和建成，如钾、铁、镁、钙等 。 ? 植物组织培养培养基成分：

? （1）无机盐类

? 大量元素：N、S、P、K、Ca、Mg等 ? 微量元素：Fe、Mn、Cu、Zn、Cl、B、Mo等

? 通常无机盐浓度为25mmol/L左右，硝酸盐浓度一般为25～40mmol/L，其中必须添加钾元素，浓度在20mmol/L或更高，磷、镁、钙、硫元素浓度在1～3mmol/L。 ? （2）碳源

? 最常采用的碳源为蔗糖，用量在2%～3%范围内。 ? （3）有机氮源

? 通常采用的有机氮源有蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基酸混合物。

? （4）植物生长激素（用量常在0.1～1mg/L）

? 生长素能促进细胞分裂，促使根的形成，最常用的有吲哚乙酸（IAA），2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）。吲哚乙酸是一种吲哚类具有生长素活性的广谱性植物生长调节剂，目前主要用于植物组织培养、诱导愈伤组织形成、促进生根。吲哚丁酸主要应用于促进插条生根。萘乙酸促进植物生长、插条生根。2，4-D用途随浓度而异，效果不一，在较低浓度下是植物组织培养的成分之一，促进愈伤组织的形成。

? 细胞分裂素通常是腺嘌呤衍生物：6-苄基嘌呤（BA）、玉米素（ZT）、激动素（KT）。6-BA是诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长，促进细胞分裂与扩大抑制根的分化。 ? （5）维生素

? 维生素作为植物细胞分裂、分化的生理活性物质，在植物细胞内主要以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。常用的维生素有：盐酸硫胺素（维生素B1)、烟酸（维生素B3）、盐酸吡哆素（维生素B6）、抗坏血酸（维生素C）。一般采用的维生素浓度为0.1～1mg/L。 ? （6）肌醇

? 又叫环已六醇，可促进愈伤组织的生长和胚状体及芽的形成。常用浓度为50～100mg/L。 ? （7）复合物

? 通常为细胞生长调节剂，包括酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等。一些抽提液对细胞有毒性，现在已被已知成分的营养物质代替。目前仍广泛使用的是椰子汁。

? 组培常用基本培养基是MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA等培养基。调pH5.5～5.8。 ? 培养基及器械的消毒：

? 玻璃培养仪器及无菌操作所用的水、滤纸、纱布、各种器械如解剖刀、解剖剪、解剖针、镊子等通常与培养基一起事先用高压灭菌锅灭菌备用。

? 四、植物组培的基本步骤 ? 1、培养材料的采集 ? 2、材料消毒 ? 3、制备外植体 ? 4、接种和培养 ? 5、诱导生根

? 6、炼苗、移栽

? 1、培养材料的采集

? 理论上全能植物细胞有3类： ? （1）受精卵

? （2）根尖、茎尖、叶、花等分生组织细胞 ? （3）雌雄配子及单倍体细胞，如花药、花粉粒等

? 在快速繁殖应用中，通常用茎尖，一般切0.5cm左右；如果想要脱毒苗，通常只切茎尖0.1mm以内的部分，因为茎尖分生组织没有分化出维管组织，病毒难以感染到这个部位，但一般说来，外植体越小，培养难度越大。 ? 2、培养材料的消毒

? 材料先用自来水冲洗干净→用蒸馏水冲洗（以下在超净台上进行无菌操作）→无菌水冲洗→无菌滤纸吸干水→已消毒解剖刀切成小块→70%酒精浸泡30～60s→移入漂白粉饱和液或0.01%升汞（HgCl2）消毒10min左右→无菌水冲洗→无菌滤纸吸干水 常用消毒剂效果的比较

? 植物组织培养中常遇到的问题－－污染

? 污染连同褐变、玻璃化被称为植物组培三大难题。 ? 1、污染的原因

? （1）外植体材料表面消毒不彻底或内生菌随材料带入； ? （2）培养基和接种工具消毒不彻底； ? （3）接种室和超净台不符合要求； ? （4）操作人员不遵守操作规程； ? （5）培养过程中环境空气不洁净污染等。 ? 2、污染的控制

? （1）将材料冲洗足够干净，严格消毒灭菌。可采用多次灭菌法。 ? （2）在培养基中加入一定量的抗生素，如青霉素、链霉素、新霉素、卡那霉素等，但抗生素对培养物的生长和分化会产生一定的抑制，应避免长期使用。

? （3）培养基灭菌时，要检查高压灭菌的温度、压力、时间及操作是否正常等。

? （4）接种室定期用紫外灯照射或酒精喷雾或甲醛薰蒸等。超净台接种前用酒精擦拭后再开机灭菌。

? （5）接种前，接种人员要严格消毒，认真洗手，酒精擦手；在接种时规范操作，常用酒精擦手。接种工具常在酒精灯火焰上灼烧。接种前后培养器皿开口需转动烘烤。 ? 3、制备外植体

? 用消毒工具将表面消毒的材料作些处理（芽除鳞片、嫩枝除外皮、种子去种皮、去胚乳等，叶片直接切成0.2～0.5cm小片，想要脱毒

? 必须首先解决的重要问题：细胞生长及代谢途径基础研究、反应器结构与工艺优化

? 七、植物细胞两相培养技术

? 两相培养技术——在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢产物分泌出来后转移到有机相中的技术。其优点是：不仅减少了产物的反馈抑制作用，提高产物含量，而且通过有机相的回收循环使用实现了连续培养。这种技术最初是应用于蛋白质提取、乙醇发酵及微生物培养上的。 ? 两相培养系统满足条件：

? 1、添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无毒，不会影响细胞生长。 ? 2、产物能比较容易被有机物吸附或溶解于有机相中。 ? 3、两相容易分离

? 4、有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分。 ? 八、植物细胞的生物反应器固定化培养

? 细胞固定化——将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术。 ? 常用的固定化方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法等。常采用包埋法，可以采用海藻酸盐、卡拉胶、琼脂、琼脂糖、角叉藻胶、白明胶等作为包埋剂。

? 九、植物细胞培养存在的问题与发展趋势 ? 1、存在问题 ? （1）技术问题

? 生物反应器设计缺陷多 ? 细胞易聚集分层、易变异 ? 放大培养不足 ? （2）经济方面

? 成本高、工业化经济效益低 ? 2、发展趋势

? （1）高效细胞系的筛选

? （2）发展大规模细胞培养所用的培养基，降低成本 ? （3）开发出适合植物细胞大规模培养的生物反应器系统 ? （4）两相培养、固定化培养技术是极具发展前景的技术

? （5）对细胞分化、次生代谢产物和培养条件之间的关系进行基础研

究

第5节 植物原生质体培养 ? 5.1 定义、特点及用途 ? 5.2 原生质体的制备 ? 5.3 原生质体的培养

? 5.4 原生质体的发育和植株再生 ? 一、原生质体 ? 1、定义

? 在植物细胞中除细胞壁以外的成分就称为原生质体，植物原生质体实际上就是除去细胞壁的裸露球形细胞。 ? 2、特点及用途

? 含有核、质、膜及各种细胞器，只是没有细胞壁。方便进行各种遗传操作，并能摄取外源基因、细胞器、染色体、质粒、病毒、细菌等外源物质，是植物细胞工程进行遗传操作、基因转移的良好实验材料。也可以进行细胞生理生化研究，并且原生质体具有细胞全能性，能够再生出细胞壁并生长发育成完整植株，也可研究细胞壁的形成。另外也容易克服不同种细胞间的不亲和障碍，容易实现细胞融合和细胞杂交，培育新品种。 ? 二、原生质体的制备 ? 1、来源

? 植物体的细嫩部分是制备原生质体的理想材料，比如双子叶植物的幼叶、子叶、根、下胚轴的切段、花粉等。叶片由于取材容易而广泛采用，但单子叶植物特别是禾本科植物叶片表面常含有硅质不易被酶液降解，不适宜用来制备原生质体，通常用其组培产生的愈伤组织或悬浮培养的细胞。 ? 2、分离

? （1）机械法（最初方法）

? 先将材料放在高渗蔗糖溶液中使细胞发生质壁分离，最后原生质体收缩成球形完全与细胞壁脱离，此时用剪刀剪碎组织、切破细胞壁，使原生质体释放出来。这种方法操作难度大，产量低，费时费力，且无法从分生组织中分离得到原生质体。 ? （2）酶解法（常用方法）

这是1960年英国诺丁汉大学的科金创立的分离制备大量植物原生质体的方法。利用从漆斑霉提取的纤维素酶粗制剂，从番茄幼苗根尖分离出

大量原生质体。这种方法条件温和、原生质体完整性好、活力高、得率高。制备原生质体常用的酶有：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、琼脂酶、蜗牛酶等。

? 例：科金分离制备番茄根尖原生质体方法步骤： ? （1）取材消毒：

? 将鲜嫩植物组织水洗后用70%酒精浸泡1min，再用8%次氯酸钠浸泡1min表面消毒，无菌水洗3～4次。 ? （2）酶解制备

? 超净台上25～28℃恒温水浴60～90min。 ? （3）原生质体收集

? 用300～400目不锈钢网过滤酶解材料，弃去残渣，600r/min离心10min，弃上清，沉淀悬浮在0.16mol/LCaCl2·2H2O溶液中，缓缓注入20%蔗糖溶液，同速离心10min，收集两液面间原生质体带备用。 ? 3、纯化

? （1）过滤-离心法

? 40～100μm网筛－低速离心数次 ? （2）漂浮法

? 25%蔗糖溶液中漂浮－吸管 ? （3）沉降法与漂浮法结合

? 低速离心－21%蔗糖悬浮离心－洗涤液离心（2次以上） ? 4、鉴定

? （1）低渗爆破（低渗吸水膨胀）

? 吸水胀破后不成形－真原生质体

? 吸水胀破后保持一定形状－带有部分细胞壁 ? （2）荧光染色（0.05%～0.1%荧光增白剂） ? 发红光－真原生质体 ? 发绿光－细胞壁未分解完全 ? 5、活力测定

? （1）染色法（FDA、酚藏花红、伊文思蓝）

? ①FDA（荧光素双醋酸盐）法：本没有荧光，能透过原生质膜，并在内酯酶作用下水解为不能排出、积累在质膜内的荧光素。 ? 发绿光－活 不发荧光－死

? ②酚藏花红染料法：不着色－活 红色－死 ? ③伊文思蓝染色法：不着色－活 蓝色－死 ? （2）胞质环流法

? （3）渗透压变化：吸水、失水－活，不变－死 ? （4）氧电极法：O2↑↓－活，不变－死 ? 三、原生质体培养 ? （1）液体培养法 ? （2）固体平板法 ? （3）双层培养法

? 四、原生质体的发育和植株再生 ? （1）细胞壁再生 ? （2）细胞分裂

? （3）愈伤组织或胚状体的形成

? （4）植株再生（愈伤组织诱导、诱导胚状体）

植所采用技术物细胞工程 的理论基础 植物细胞的全能性 植物组织培养 通常采用的技术手段 植物细胞培养 植物原生质体培养与体细胞杂交

第三章小结：

? 一、植物组织培养（概念、原理、培养条件、常用仪器、步骤、应用、人工种子等）

? 二、植物细胞培养（概念、理论基础、方法分类、培养条件、常用仪器、制备方法、培养方法、保存方法、应用、固定化培养及方法等） ? 三、两相培养技术（概念、优点、条件）

? 四、植物原生质体培养（概念、用途、制备、培养、再生植株方法及技术路线等）

思考题：

1、什么是植物组织培养和细胞培养？有怎样的区别？ 2、举例说明植物组织培养的快速繁殖技术的步骤和方法。 3、植物组织培养的主要意义有哪些？最新进展如何？ 4、植物细胞培养最主要的用途体现在哪里？举例说明。 5、植物细胞培养的营养成分主要包括哪些？ 6、什么是两相培养技术？有什么优点？

7、简述原生质体培养再生完整植株的技术路线。

补充思考题：

? 1、为什么茎尖分生组织培养能够获得脱病毒植株？

? 2、培养基、外植体、玻璃器皿、金属用具等一般选择怎样的灭菌方法？ ? 3、目前用作原生质体分离的材料有哪些？

? 4、哪些类型的外植体适宜用作建立悬浮细胞系起始培养物？ ? 5、一个好的植物悬浮细胞系有哪些特征？ ? 6、人工种子利用有何优点？

第四章 动物细胞与组织培养 ? 一、动物细胞的特点

? 二、动物细胞与组织培养的定义 ? 三、动物细胞的体外培养生长特性 ? 四、动物细胞、组织培养的基本技术 ? 五、组织工程 ? 六、器官培养 ? 七、干细胞

第1节 动物细胞的特点

? 动物细胞与微生物细胞相比，有以下特点： ? 1、比微生物细胞大，没有细胞壁； ? 2、动物细胞间主要以聚集体形式存在； ? 3、生长慢，周期长，易受污染；

? 4、原代细胞一般繁殖50代左右就退化死亡；

? 5、需O2少，对剪切力敏感。

第2节 动物细胞与组织培养的定义

? 动物细胞与组织培养——从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。

? 原代培养——将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程。实效培养的细胞大约增殖10代左右，称原代细胞。

? 传代培养——从原代培养的细胞继续转接培养的过程。 第3节 发展历史（自学）

第4节 动物细胞体外培养的生长特性

? 一、贴附型细胞

? 贴附生长的细胞。也就是细胞与细胞之间接触、与细胞外基质结合生长。大多数哺乳动物细胞属于此类型。

? 1、成纤维细胞型细胞（如人胚肺细胞、小鼠成纤维细胞等） ? 2、上皮型细胞（如表皮细胞、宫颈癌细胞等） ? 3、游走型细胞（如淋巴细胞、巨噬细胞等） ? 4、多形型细胞（如神经元、神经胶质细胞等）

? 二、非贴附型细胞（悬浮生长，如血液白细胞、淋巴组织细胞）

第5节 动物细胞、组织培养的基本技术 ? 5.1 培养工具 ? 5.2 培养条件 ? 5.3 动物细胞培养的传统方法 ? 5.4 原代培养与传代培养技术 ? 5.5 贴壁培养技术

? 5.6 动物细胞大规模培养技术 ? 5.7 动物细胞生物反应器大规模培养 ? 5.8 细胞冷冻保存技术 ? 5.9 动物细胞体外培养举例 ? 5.10 动物细胞体外培养现状与展望

? 一、培养工具

? 培养器皿（玻璃、塑料）、空心纤维、微珠 ? 二、培养条件 ? 1、温度（37℃） ? 2、pH值（pH7.2～7.4） ? 3、气体（O2、CO2）

? 4、营养（氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素、生长因子、葡萄糖、无机盐等，其中多种成分可由血清提供） ? （1）天然培养基（血清、鸡胚汁等）

? （2）合成培养基（MEM、DMEM、DME等） ? （3）无血清培养基（SFRE199-1等）

此外还有一种微囊法，是美国Damon Biotech公司发明的方法。具体是：将细胞悬浮于海藻酸钠溶液中，迫使其通过一种成滴装置后滴入溶液，即形成半透膜微囊，把细胞包在内，培养时废物可通过半透膜排出，所需要的大分子产物如抗体则被阻留积累在囊内，最后只需离心收集微囊并打开囊膜，就可分离获得高浓度的未经培养液血清污染的大分子产物。

? （1）天然培养基

? 直接采用动物体液或从组织中提取的成分作为培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等，其中血清是最常用最有效的，已知血清中含有：

? ①蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ? ②氨基酸

? ③葡萄糖

? ④激素（胰岛素、生长激素等） ? ⑤金属离子

? ⑥促贴附物质（纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等） ? ⑦生长因子（EGF、FGF、MSA、IGF等） ? ⑧维持细胞生长繁殖及保持生物学性状不明成分

? 血清常用牛血清和马血清（HS,horse serum），牛血清又分为胎牛血清（FBS,fetal bovine serum）和犊牛血清（CS,calf serum）。血清质量好坏是实验成败的关键。

? 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染

? 血清的消毒：过滤除菌

? 优点：营养成分丰富，培养效果好。

? 缺点：来源有限；成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析；易发生支原体污染；影响后期分离、纯化细胞产物；成本高。 ? （2）合成培养基

? 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的培养基，如MEM、DMEM、DME、M199、F12、RPMI－1640等培养基，需加入5～20%血清，最常用10%小牛血清。

? 优点：成分已知，便于对实验条件控制，能进行标准化生产，成本低。 ? 缺点：不能完全取代天然培养基的成分，需加入血清，具血清的缺陷。 ? （3）无血清培养基

? 一般由基础培养基、生长因子和激素、基质组成，主要以各种激

素、生长因子、维生素、载体蛋白、微量元素、乙醇胺以及贴壁与展开因子取代含血清培养基中的血清部分。常用培养基有DME、F12、RPMI－1640等，其中又以1︰1的DME和F12混合培养基最为常用。专用无血清培养基如SFRE199－1、NCTC135等。常用基质有纤黏素、血清铺展因子、胎球蛋白、胶原等。

? 优点：排除了血清的干扰，保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。 ? 缺点：不同细胞株添加因子不同；处于研究阶段，难以推广。 ? （4）培养必需的溶液 ? ①BSS（Hanks、Earle等）

? ②pH调整液（NaHCO3、HEPES等） ? ③细胞消化液（胰蛋白酶、EDTA等）

? ④抗生素溶液（青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等） ? ①BSS（Hanks、Earle等）

? 由生理盐水和葡萄糖配成，用于维持细胞的渗透压、维持pH和细胞正常的代谢等。

? 葡萄糖在培养液中的含量一般为1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖）。 ? Hanks 平衡盐溶液(HBSS) 和 Earle平衡盐溶液(EBSS)的主要差别在于碳酸氢钠的水平，在Earle(2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。 Hanks 液缓冲能力较弱，Earle液缓冲能力较强。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的pH值。Earle液在空气水平的CO2 中会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。Hanks 液要在空气中使用，不需要CO2培养箱。如果希望在CO2培养箱中保存

组织，需要用Earle液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 ? ②pH调整液（NaHCO3、HEPES等）

? 常用的有3.7%、5.6%、7.4%NaHCO3、HEPES液（二羟乙基哌嗪乙烷磺酸）等。

? 培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为3.7 g/L 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为1.5 g/L 时， 则应使用5%CO2 培养细胞。

? ③细胞消化液（胰蛋白酶、EDTA等）

? 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。适用于消化细胞间质比较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾以及传代等。 ? 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。

? 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca 2+、Mg2+的PBS缓冲液配制。常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 ? 胰蛋白酶液消化时间：2～10分钟。 ? ③细胞消化液（胰蛋白酶、EDTA等）

? EDTA（乙二胺四乙酸二钠）是一种化学螯合剂，对细胞具有一定的非酶性解离作用。常用浓度是0.02％ 。

? 也可以将两种消化液以1︰1或1︰2的比例混合使用，用于消化组织、传代细胞等。因二价离子会抑制胰蛋白酶活性，EDTA可以螯

合游离的Mg2+和Ca 2+，以便保持胰蛋白酶的活性。做法可以是：用胰蛋白酶处理细胞前，先用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中的二价离子。

? ④抗生素溶液（青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等） ? 严格来说，动物细胞应培养在不含抗生素的培养基中，因为抗生素对某些细胞有毒，而且有时会产生假性数据。在一般正常培养状态下，除特殊筛选系统外，培养基中不应添加任何抗生素。

? 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为100单位/mL。

? 庆大霉素：100单位/mL——方便、广谱、稳定

? 当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。因为血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。 完全培养基的组成

? 基础培养基 80％～95％ ? 血清 5％～20％ ? 碳酸氢钠 2.0 g/L ? 青霉素、链霉素 各100单位／mL 一般培养基的配制

RPMI-1640培养粉 1袋

碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位／mL 加三蒸水 至 1000mL，过滤除菌。

调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10％）

一般培养液都含酚红作为pH指示剂，中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色，是细胞培养液状态的一个很好的标志。过长时间的培养或者微生物的污染都会使培养液的pH发生改变。需要注意的是，研究表明，酚红可以模拟类固醇激素（尤其是雌性激素）的作用，所以如果培养的细胞对雌性激素敏感（比如实验本身就是研究雌性激素对细胞的作用），为避免固醇类反应，就应当使用没有酚红的培养液。另外由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，使用不加有酚红的培养液。

? CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。 ? 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：

? ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ? ②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ℃ ，14 h)。 ? ③箱内将无菌蒸馏水3000mL置蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发（至少每两周一次）。 清洁液的配制

培养用品清洗和消毒程序

白箭头：玻璃制品 黑箭头：橡胶制品

? 动物细胞、组织培养体系：

? 动物细胞可以利用整体生物（如鸡胚），或离体器官（如鼠肝）或血液（如淋巴细胞），特别是在必要时使用温和酶解技术建立动物细胞培养体系。在理论上可以利用任何来源的有活力的具核细胞进行培养。但实践中，使用幼嫩的、生长活跃的组织实验的成功率最大。 ? 动物细胞培养的原则： ? （1）安全性

? 了解细胞培养传染的潜在危险性是十分重要的。尽管与人类细胞相比，禽类与啮齿类动物传播疾病的几率较小，但所有细胞培养都必须看作是致病微生物的潜在来源，任何时候都要采用无菌技术，需要

遵循安全规则。 ? 动物细胞培养的原则： ? （2）连续培养细胞系

? 刚分离的新鲜细胞能反映活体细胞的生化活性，但其培养寿命有限，长期研究需反复分离。连续细胞系相对容易培养，其培养时的生长需求已经研究清楚，特别是对已广泛应用的细胞系(如BHK、HeLa)的了解更清楚。因为连续细胞系是无性系，其反应更容易重复，结果比原代培养物较少变化。 ? （3）对固体基质的要求

? 有些细胞附着在固体表面才能生长，贴壁依赖是原代培养有限细胞系的典型特征。这些细胞一旦在附着表面形成连续的单层，则表现出依赖密度的生长抑制现象。使用―微珠载体‖作为特定的支持物可以培养这些细胞。相比之下，许多连续细胞系可以以单个细胞或细胞团的形式维持在悬浮培养基中。

体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长。当细胞铺满培养器皿的表面时，正常的细胞停止生长，但是转化（即发生遗传物质突变）的对接触抑制不敏感的细胞会继续生长。如果不及时传代，这些转化的细胞就会逐步取代正常的细胞。 ? （4）理化条件

? 包括pH（一般为7.2～7.5）、缓冲能力、渗透压和温度(如哺乳动物细胞为35～37℃) ? （5）对培养基的要求

? 包括无机离子、碳源、其他有机养料、抗生素等。常在培养基中加入血清或含有蛋白质、多肽、激素、脂类和微量元素的类血清附加物。考虑体外CO2和O2的水平：许多细胞培养使用碳酸氢盐做缓冲液，这样维持空气中高含量的CO2。用pH调整液维持pH平衡。有时可在培养基中加入pH敏感的染料（如酚红），在动物细胞生长过程中直接检测pH状态。 ? （6）对设备的要求

? 使用超净工作台或安全操作间，为了减少微生物污染，需使用合适的培养容器（如灭过菌的一次性聚苯乙烯培养板、瓶和培养皿），经处理，这些容器表面带负电荷，亲水性好。在细胞生长过程中高质量纯水（蒸馏、去离子和碳过滤的水）、温度变化±0.5℃的培养箱，通常还具备CO2控制器和机械搅拌器，还有倒置相差显微镜用来测定生长的单层黏附细胞。 ? 三、动物细胞培养的传统方法 ? 1、悬滴法 ? 2、旋转管法 ? 3、灌注小室法 ? 4、培养瓶法 ? 5、培养板法 ? 1、悬滴法

? （1）在盖玻片上滴加胚胎提取液、血浆、植块，混匀、包埋； ? （2）在凹形载玻片周围涂凡士林，凹载片向下压向盖玻片； ? （3）反转凹载片，盖玻片周围涂熔蜡密封，培养箱培养。

? 2、旋转管法

? 为克服静止培养的不足而建立的培养方法。即将培养物在一管状培养器皿上利用旋转装置进行旋转培养的方法，使培养物可以交替接触培养液和气体环境。 ? 3、灌注小室法

? 将细胞接种于一个由上下两个盖玻片与一个金属圈密封围成的小室内，侧面有培养液流入和流出的开口，保持在一定条件下培养的方法。

? 这种方法培养液可以循环供应，由此减少细胞受代谢产物积累的影响。 ? 4、培养瓶法

? 将培养物接种于培养瓶放于培养箱培养的方法，也可以将培养物接种于盖玻片上再放入培养瓶里培养。 ? 5、培养板法（微量培养法）

? 是现代动物细胞体外培养技术最常用的一种方法，具体方法是将培养细胞接种在6孔、24孔或96孔培养板的孔内，在CO2培养箱里进行培养。

? 四、原代培养与传代培养技术 ? 1、组织块培养

? 是细胞培养技术最简单最常用的方法。 ? 原代培养过程：

? 取下组织→除杂、剪碎→ BSS液冲洗、离心取材→剪成细块→BSS液冲洗、自然沉降→留少许洗液→移入培养瓶中→吸尽洗液、加入少

量培养液薄层培养→培养24h左右补充培养液培养→细胞贴壁生长 ? 2、组织消化培养

? （1）取材分离，酶液组织消化（胰蛋白酶等） ? （2）过滤或离心除渣 ? （3）吹打分散，接种培养 ? 胰酶消化动物细胞的基本步骤:

? （1）往剪碎的组织块中加入30～50倍体积的0.25%胰蛋白酶； ? （2）在37℃水浴30～60min，每5～10min摇一次； ? （3）Hanks液漂洗2次，每次2～3min；

? （4）800r/min离心5min，弃上清液，加营养液，如有大块可用纱网过滤。

? 胶原酶对胶原和细胞间质有较强的消化作用，适用于消化纤维组织、上皮组织、癌组织等，不受Mg2+和Ca 2+的螯合影响，作用温和，无需机械振荡。胶原酶消化动物细胞的基本步骤:

? （1）往已经剪碎的动物组织块中加入5mL 2000U/mL的胶原酶液； ? （2）水浴4～48h，中间可更换酶液一次；

? （3）当组织变软分散于瓶底时，轻轻振荡散成细胞团或单个细胞，小心倒出培养液；

? （4）800r/min离心5min，弃上清液，重悬于BSS液中，再离心一次；

? （5）加入培养液制成细胞悬浮液。 ? 为什么培养的细胞要及时传代？

? 体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个

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