产a-淀粉酶的枯草杆菌的筛选与产酶条件的研究

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生产淀粉酶枯草杆菌筛选推荐度：
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产а-淀粉酶的枯草杆菌的筛选

与产酶条件的研究

1 引言

枯草芽孢杆菌（B.S）属于芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，无荚膜，需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚，是a-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌。

淀粉酶属于水解酶的一种，是淀粉水解的生物催化剂。按降解方式分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶和环糊精生成酶。α-淀粉酶以无规则的方式切断淀粉大分子内部的α-1，4糖甙键而使淀粉生成糊精、低聚糖等，因产物的末端葡萄糖残基中碳原子为α-构形，故称为α-淀粉酶。大多α-淀粉酶(个别品种除外)不能切断α-1，6糖甙键，也不能切断分支点附近的α-1，4糖甙键。目前，α-淀粉酶在我国产量较大，广泛应用于食品、酿造、制药和纺织等领域。用α-淀粉酶水解淀粉时，要注意水解条件。影响α-淀粉酶活性的主要因素有pH值、温度和金属离子[1]。

α-淀粉酶具有反应速度快、效率高、成本低等优势。对于我国来讲，一方面食品与发酵工业的发展对真菌α-淀粉酶的需求量不断增加；另一方面，由于我国目前不能自主生产真菌α-淀粉酶，每年都要大量进口，且价格昂贵。因此尽快实现国产化生产，对于满足市场需求，调整我国酶制剂工业的产业结构，节约外汇支出等都具有十分重要的意义[2]。

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2 文献综述

2.1 α-淀粉酶及其性质

2.1.1 α-淀粉酶

α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物，其国际酶学分类编号是EC．3.2.1.1，它作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖，由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1，4糖苷键，起液化作用的一类酶 [1] 。

2.1.2 α-淀粉酶的性质

一般α-淀粉酶在pH值为5.5-8.0时活性较稳定，pH小于4时，酶易失去活性。但有些α-淀粉酶是偏酸性或偏碱性的，如黑曲酶生产的α-淀粉酶最适合的pH为4，在pH为2.5、温度为40℃处理30min后仍有一定的活性，但在pH为7、温度为55℃处理15min，α-淀粉酶几乎失活。而用米曲酶生产的α-淀粉酶则相反，在pH为7、温度为55℃时处理15min，酶活性无损失，但在pH为2.5时，酶的活性完全消失。

α-淀粉酶具有反应速度快、效率高、成本低等优势。α-淀粉酶是一种金属酶，Ca2+使α-淀粉酶保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性。除Ca2+外，其它二价碱金属离子Ba2+、Mg2+等也有维持α-淀粉酶活性的作用。耐中温α-淀粉酶为适应生产工艺的高温条件，有时需添加Ca2+等稳定剂，但耐高温α-淀粉酶在Ca2+浓度很低时，稳定性就很好。在实际使用时，不需添加Ca2+等稳定剂。

2.2 α-淀粉酶的应用

α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，它占了整个酶制剂市场份额的25％左右。目前工业生产上都以微生物发酵法大规模生产α-淀粉酶。

α-淀粉酶作为保鲜剂应用在焙烤工业中生产各种高品质的产品已经有几百年的历史。最近几十年，麦芽α-淀粉酶和微生物α-淀粉酶被广泛用于焙烤工业。这些酶用于面包工业，使这些产品体积更大，颜色更好，颗粒更柔软。直到今天，焙烤工业中的α-淀粉酶一直是从大麦麦芽和细菌、真菌叶提取的。自从1955年以及1963年在英国经过GRAS级验证后，真菌淀粉酶一直作为面包的添加剂。现在，它们应用于不同领域。现代化连续焙烤过程中，在面粉中添加α-淀粉酶不仅可以增加发酵率，降低生面团粘度(改

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进产品的体积和质地)，增加生面团中糖的含量，改良面包的口感、外皮颜色和焙烤质量，还可以延长焙烤食品的保鲜时间。在储存过程中，面包颗粒变得干燥，坚硬，表皮不再清脆，导致面包的口感变差。这些变化统称为变质。每年仅仅由于面包变质而造成的损失超过一亿美元。各种传统的添加剂被用于防止食品变质，改善焙烤食品的质地和口味。最近，人们开始关注酶作为防腐剂、保鲜剂在生面团改良方面的作用，如支链淀粉酶和一淀粉酶配合可以有效的用于防腐。然而过量的α-淀粉酶会导致面包过粘。因此，最近的趋势是使用中温稳定(ITS)α-淀粉酶，它们在淀粉液化后活性很高，但在焙烤过程完成前就失活。尽管已发现大量的微生物可以生产α-淀粉酶，但是具有中温稳定性质的α-淀粉酶仅仅在几种微生物中被发现。世界上仅有诺维信、丹尼斯克等少数几家大型酶制剂公司拥有真菌α-淀粉酶生产技术与产品，而国内真菌α-淀粉酶的生产还是空白。近年来，浙江、江苏等地的几家高校相继开展了真菌α-淀粉酶的研究工作，但仍处于实验室阶段。对于我国来讲，一方面食品与发酵工业的发展对真菌α-淀粉酶的需求量不断增加；另一方面，由于我国目前不能自主生产真菌α-淀粉酶，每年都要大量进口，且价格昂贵，其市场售价一般在350～400元／Kg（9000u／g）。因此尽快实现国产化生产，对于满足市场需求，调整我国酶制剂工业的产业结构，节约外汇支出等都具有十分重要的意义[1]。

本实验主要是从土壤中分离得到产酶量相对较高的枯草芽孢杆菌，并从pH和培养温度等方面对产酶条件进行优化，最终的出最适宜的产酶条件。

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3 实验材料和方法

3.1 实验材料

3.1.1 土壤：取自蚌埠市李楼面粉厂周围的土壤。 3.1.2 所用的药品

蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠和氯化钙等。

3.1.3 所用的仪器

高压蒸气灭菌锅；pH测定仪；无菌操作台和JH752紫外可见分光广度计（上海箐华科技仪器有限公司）；KDC-160HR高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司）；AR-1140电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；HH-1数量恒温水浴锅（江苏省金荣华仪器制造有限公司）；DHZ-D冷冻恒温振荡器（江苏省太苍市实验设备厂）；电炉；烧杯；移液管；三角瓶等。

3.2 培养基的制备

3.2.1 牛肉膏蛋白胨培养基：

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，CaC12 5 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min。

3.2.2 淀粉初筛培养基：

可溶性淀粉20g，KNO32g，MgSO41.2g，KH2PO42.7g，琼脂1.5-2%，PH值为7.0。 3.2.3 复筛液体培养基：

淀粉60g，蛋白胨30.0g，Na2HPO40.05g．MgSO4·7H2O 0.1g，NaC1 0.1g，pH 7.0，0.1MPa灭菌20min。

3.2.4 复筛平板培养基：

淀粉20g，琼脂15g，pH值为7.0，加热溶化后倒平板，每皿20mL，厚3mm；

小圆滤纸片：直径5mm。 3.2.5 种子培养基：

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蛋白胨10 g/ L，酵母膏5 g/ L，葡萄糖1 g／L，NaH2PO43 g/ L，pH 7.0。 3.2.6 产酶培养基：

蛋白胨10 g/ L，酵母膏5g /L，葡萄糖1g／L，可溶性淀粉5 g/L，KI-I2PO42 g/L，MgSO4 ·7H2O 0.5 g /L，CaC12·2H2O 0.2g／L，pH 7.0。

3.3 试剂的制备

3.3.1 5 mmol／L碘液

取碘酸钾(KIO3)0.356 7 g，碘化钾(KI)4.5 g，蒸馏水800 mL搅拌混匀后，缓缓滴加，边搅边加入l2 mol／L浓盐酸0.9 mL。混匀后加蒸馏水至1000 mL。此液置琥珀色瓶中。

3.3.2 1mol／L NaOH

取4g固体NaOH放入100mL蒸馏水，混匀。 3.3.3 1mol／L 硫酸

取10mL浓硫酸倒入100mL蒸馏水中，搅拌混匀。

3.4 实验方法

3.4.1 初筛[3]

称取土样 5g，倒入盛有95mL无菌水带玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡 30 min制成土壤悬液记为 l0-1土壤稀释液。用无菌移液管吸取 10-1的土壤悬液 0.5 mL，放入 4.5mL无菌水中，混匀即为 l0-2稀释液，照此分别制成 l0-3～ l0-6 的稀释液，分别取 10-4、l0-5、l0-6土壤稀释液各0.5 mL，涂布于淀粉初筛平板培养基表面，每个稀释度涂布3块平板，37℃下恒温培养 18h，待长出菌落后，滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，反复划线分离纯化，斜面保存，作为初筛菌株编号保藏。

3.4.2 复筛[4]

将初筛菌株接种到复筛液体培养基中进行液态培养，发酵48h后，取直径 5 mm的小圆滤纸片，放于 3 mm厚的复筛固体培养基上，用毛细管吸取等量发酵液，分别滴到小圆滤纸片上，65℃培养2h后，滴加稀碘液，测水解圈直径。

3.4.3 鉴定[5]

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? 菌落培养特征观察：用接种环沾取少量菌苔在牛肉膏蛋白胨平板上划线，37℃培养3-7d，从以下几个方面观察单菌落的形态特征：大小，颜色，形态，边缘，高度，透明度。

? 细菌个体形态的观察：革兰氏染色，油镜下观察菌株个体形状、排列、大小、芽孢有无及其形状、大小和着生位置。

? 细菌运动性的检查（半固体穿刺法）：用接种针沾取少量试验菌穿刺营养琼脂，适温培养2-3d，观察试验菌是否沿穿刺线向外扩散。（穿刺法：是由斜面菌种接种到固体深层培养基的方法。即用接种针取出少许菌台，自固体深层培养基中心垂直刺入直到试管底，然后轻轻退出。）

? 细菌的生理生化反应：

①氧化酶试验：取滤纸一张置于培养皿内，滴上二甲基对苯撑二胺，滴入量以滤纸湿润为度。如果加得过湿有碍菌苔与空气接触，延长显色时间，造成假阴性。用白金耳接种环挑18-24h的菌苔，涂抹在滤纸上，如呈玫瑰红色为阳性，在1min以后显示者仍按阴性处理。

②接触酶试验：接种试验菌，适温培养18-24h，将3%的过氧化氢滴于菌苔上，静置1-3分钟后，观察有无气泡产生，如有则为阳性。

③葡萄糖氧化发酵试验：将培养18-24h的菌株穿刺接种于葡萄糖氧化发酵培养基，每株接四支（培养基在使用前用沸水融化后迅速用冷水冷却，凝固后立即使用）。其中的两支用液体石蜡封管，隔绝空气为闭管，另外两只不封为开管。同时还要有不接种的开闭管为对照。30℃培养，在第1，2，4，7d个观察一次。氧化产酸：仅开管产酸变黄，而且培养基上层产酸变色部分不超过1cm。发酵产酸：开管闭管均产酸，沿穿刺线产酸变色。如产气，则在琼脂柱内产生气泡。

④V·P实验与M·R试验：两个试验的培养液相同，接种培养也相同，将试验菌接种于培养液中，适温培养2、4、6d。试验时取培养液1毫升加等量40%NaOH和0.5ml а-萘酚，用力振荡，15-30min后观察其颜色变化。红色则为阳性，黄色则为阴性。M·R试验，在培养液中加1-2滴甲基红试剂，如呈红色则为阳性，黄色则为阴性。

⑤淀粉水解试验：将试验菌在平板上点种，适温培养2-7d，滴加碘液于菌落上，如菌落周围为蓝色，表示未水解，观察菌落周围或菌落下有无无色透明圈，如有或呈红紫色则为阳性。

⑥明胶液化试验：将试验菌的幼龄菌体穿刺接种在明胶培养基中，以不接种的为对照，置20℃培养。在第4d取出于20℃以下的环境中观察菌的生长情况及液化形状。若

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明胶表面无凹陷，凝块稳定则为明胶液化阴性，如明胶凝块部分或全部在20℃以下变为可流动的液体，则为明胶液化阳性。

⑦吲哚产生试验：培养液接种试验菌后适温培养，取培养2-7d的培养液，沿管壁缓缓加入3-5ml的吲哚试剂，液层界面出现红色表示产生吲哚，即为阳性。

⑧柠檬酸盐生长试验：将试验菌在平板上点种，适温培养3-5d，如该菌可在平板上生长并将培养基由原来的淡黄色变为玫瑰红色，则为阳性，颜色不变者为阴性。

⑨碳源的利用：将菌株在平板上点种，适温培养3-5d，同时每个试验菌都做一个未加含碳化合物的基础培养基作为对照。试验菌在含碳化合物培养基的生长明显超过基础培养基者为阳性，否则为阴性。

⑩耐盐性试验：将牛肉膏蛋白胨培养液中加入不同量的NaCl，如2％，5％，7％，10％等制成渗透压不同的培养液，接种，室温培养3-7d与对照管比较目测其生长状况，判断其对不同渗透压得耐受性。

3.4.4 酶活测定以及酶活定义[6]

采用 Yoo改良法，取 5mL质量分数0.5％可溶性淀粉溶液，在37℃ 水浴中预热 10 min，加入适度稀释的粗酶液0.5 mL，37℃ 水浴震荡，准确反应 5 min后，用5 mL 0.1 mol／L H2SO4终止反应。取 0.5 mL反应液与 5 mL稀碘液显色，在620 nm处测光密度。以0.5 mL水代替 0.5 mL反应液为空白，以不加酶液(加同体积的缓冲液)的管为对照。酶活力根据以下公式计算：

酶活力(U)= (R0一R)×50×D／R。

式中：R0，R分别表示对照和反应液的光密度，D为酶的稀释倍数。

酶活定义为在 37 ℃ ，pH 6.0条件下，5 min内水解 1 mg淀粉的酶量为1个活力单位。

3.4.5 不同培养条件对产酶的影响 ? 起始PH对产酶的影响

在250 mL三角瓶中装入不同起始pH值的培养基50mL，起始PH分别是5、6、7、8和9，每个三角瓶接入种子培养基1ml后培养24h。

? 温度对产酶的影响

选取25、30、35、40、45℃作为培养温度，在摇瓶发酵培养条件下培养24h，分别测定不同温度对酶活的影响。

? 培养时间对产酶的影响

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在250 mL三角瓶中装入50mL发酵培养基，每个三角瓶接入种子培养基1ml后分别培养6h、12h、24h、36h、48h、96h分别测不同培养时间下的酶活 [7] 。

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4 实验结果

4.1 初筛结果

表4-1 水解圈直径比

菌株 B1 B2 B3 B4 B5

菌体（D,mm）

2.5 2.8 2.0 2.1 1.7

水解圈(d,mm)

7.8 6.9 7.1 6.9 4.5

d/D 3.12 2.46 3.55 3.29 2.65

利用淀粉固体培养基进行初步分离，能够在其上生长，并且有淀粉水解圈产生的菌株即为要筛选的目的菌株。通过大量筛选，我们得到五株d/D较大的菌株，并斜面保存，以供后期复筛所用。

4.2 复筛结果

表4-2 水解圈测量

菌株 B1 B3 B4

滤纸片（D,mm）

5.0 5.0 5.0

水解圈(d,mm)

16.0 14.5 15.3

d/D 3.20 2.90 3.06

王丽丽等在进行产酶菌株的筛选时发现，平板菌落水解圈直径与其摇瓶酶活不相关，为此，本实验采用王丽丽等的筛选方法进行复筛，得出三个菌株的水解圈较大，斜面保存。

4.3 鉴定

对复筛出的三个菌株进行菌种鉴定，根据《伯杰式细菌鉴定手册》[8]，《常见细菌

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鉴定手册》[9]，对照查找鉴定结果。

表4-3 细菌鉴定结果

性状 G染色芽孢细胞形状接触酶氧化酶运动性淀粉水解 M.R V.P 柠檬酸盐吲哚明胶液化葡萄糖氧化发酵产酸

表4-4 细菌耐盐性实验

盐浓度 2% 5% 7% 10%

B1 + + + +

B3 + + + +

B4 + + + -

B1 + 有长杆状 - + + + + + + + + +

B3 + 有长杆状 - + + + + + + - + +

B4 + 有杆状 + - + + + - + - + -

表4-5 碳源利用实验

碳源葡萄糖乳糖蔗糖甘露醇

B1 + + + +

B3 + + + +

B4 + + + +

B1和B3菌落呈不规则状，不透明，干燥，色暗，革兰氏反应为阳性，芽孢椭圆状，中生，B4菌落边缘为毛发状，不透明，干燥，不宜挑起，革兰氏反应为阳性，杆状，芽

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孢中生。同时根据以上生理生化试验，对照鉴定手册，初步认为B1和B3为枯草芽孢杆菌，B4疑似为地衣芽孢杆菌。

4.4 不同条件对产酶的影响

本实验从土壤中筛到两株产酶能力较强的菌株B1和B3，经鉴定初步认为是枯草芽孢杆菌，对这两株枯草芽孢杆菌进行液态发酵，37℃，24h，测得两株枯草芽孢杆菌的酶活如图4-1所示。

酶活（U/ml）1716.51615.51514.51413.51312.5B1菌株B3

图4-1 不同菌株的酶活

由图4-1可知，B1的酶活相对B3略高一些，这与复筛时，透明圈的直径比值相符。本实验采用B1做发酵条件对产酶的影响。

4.4.1 起始pH

由于采用摇瓶发酵，发酵过程中的pH值不好控制，所以本实验研究起始pH对产酶的影响。在250 mL三角瓶中装入不同起始pH值的培养基50mL，起始PH分别是5、6、7、8和9，37℃培养24h。起始pH对产酶的影响如图4-2。

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相对酶活（%）120100806040200567pH值89

图4-2 起始pH值对酶活的影响

由图4-2可知，该菌株对pH的适应性较广，在5-8的范围内都能很好生长，最适pH为7。pH主要通过影响菌体细胞膜电荷、膜渗透性及营养物质离子化程度，从而影响菌体对养分的吸收[10]。随着pH的增大，酶活显著降低，因为其pH已经超过了菌体的适应范围。

4.4.2 培养温度

选取25、30、35、40、45℃作为培养温度，在摇瓶发酵培养条件下培养24h，分别测定不同温度对酶活的影响。结果见图3-3。

相对酶活（%）120100806040200253035温度（℃）4045

图4-3 温度对酶活的影响

该菌株的温度适应性较强，在上述温度中都能很好生长，但是最佳生长温度还是37℃，在30℃-40℃的范围内，产酶能力都比较强。温度主要通过改变酶反应速率来影响菌体的生长。一般培养基温度升高，酶反应速率增大，生长代谢加快，生产期提前。但酶很容易因过热而失去活性，表现为菌体容易衰老，所以，培养温度稍高时，酶活会有

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所下降[10]。

4.4.3 培养时间

该菌株在37℃下，培养6h 、12h、24h、36h、48h，96h，分别测不同培养时间下的酶活。结果如图4-4。

120100相对酶活（%）8060402006122436时间（h）4896

图4-4 不同培养时间对产酶的影响

由图可知，该菌株在12-48h产酶能力都比较强，最佳产酶的时间为24h。这是由于，菌体在前12个小时，处于生长延滞期和对数生长期，此时菌体以生长为主，产酶较少，随后菌体生长处于稳定期，此时产酶能力较强，随着时间的延长，由于能量的消耗，菌体生长处于衰亡期，产酶的能力也相应减少。

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5 结论与展望

5.1 结论

5.1.1 初筛和复筛的结果

利用淀粉平板做为初筛培养基，从土壤中筛选到五株产淀粉水解圈较大的菌株，对初筛到的菌株进行复筛，采用摇瓶发酵培养和平板培养相结合，复筛选出三株产酶能力强的菌株。

5.1.2 鉴定结果

通过细菌的形态观察和生理生化实验，对照《伯杰式细菌鉴定手册》[8]，《常见细菌系统鉴定手册》[9]，初步认为其中的两株为枯草芽孢杆菌，一株疑似为地衣芽孢杆菌。

5.1.3 不同条件对产酶的影响

? pH值是菌种生长的化学因子,对微生物生长的影响很大。在培养微生物时，pH可以引起细胞膜电荷变化,以及影响营养物离子化程度，从而影响微生物对营养物的吸收。经试验得知，本试验菌株产酶的最适PH为7.0左右。

? 温度主要通过改变酶反应速率来影响菌体的生长。一般培养温度升高，酶反应速率增大，生长代谢加快，生产期提前。但酶很容易因过热而失去活性，表现为菌体容易衰老，影响最终产量。温度主要通过影响生物细胞膜的流动性和生物大分子的活性来影响微生物的生命活动。一方面，随着温度的升高，细胞内的酶反应速度加快，代谢和生长也相应的加快；另一方面，随着温度进一步增高，生物活性物质发生变性，细胞功能下降，甚至死亡。所以，每种微生物都有一个最适宜的生长温度。同样，每种微生物都有一个最适宜某种代谢产物产生的最适温度。由试验可知, 枯草杆菌发酵产α-淀粉酶的最适温度为37℃。

? 微生物的生长阶段有适应期、对数期、稳定期和衰退期，并且每种微生物生长阶段的时间性都不一样。经研究知道该菌株在培养24h左右产酶较高。

本试验只是对枯草杆菌液态发酵产α-淀粉酶条件的单因素进行研究，除上述实验以外，还可以对培养基进行进一步的优化，比如，不同氮源，接种量，搅拌速度等也是重要的培养参数。在找到各单因素最佳结果后，还可以进行正交试验，来探讨多种因素时的最佳产酶条件。同时可以对枯草杆菌固态发酵产α-淀粉酶的条件加以研究。

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5.2 a-淀粉酶的应用前景与展望

国内a-淀粉酶类的生产和应用1965年，我国开始应用淀粉芽孢杆菌BF一7658生产a-淀粉酶。1964年我国开始了酶法水解淀粉生产葡萄糖工艺的研究。l979年9月通过了酶法注射葡萄糖新工艺的鉴定，并先后在华北制药厂、河北东风制药厂、郑州嵩山制药厂等单位得到应用，取得了良好的经济效益。与传统的酸法相比呵以提高收率 10％，降低成本15％以上。另外我国以酶法进行柠檬酸生产、谷氨酸发酵、糖化制啤酒、酒精发酵、黄酒酿造、酱油制造、醋生产等方面也已经研究成功并投入生产。

目前国外α-淀粉酶研究除开展大量常规诱变育种工作外，国外已初步搞清产α-淀粉酶的调控基因，探讨了有关转导转化和基因克隆等育种技术。将枯草芽孢杆菌重组体的基因引入生产菌株，使α-淀粉酶产量提高7～10倍，并已应用于食品和制酒工业，给选育高产α-淀粉酶菌株开创了新的途径。

α-淀粉酶已经成为工业应用中最为重要的酶之一，并且大量的微生物可以用以高效生产淀粉酶，但是酶的大规模商业化生产仍然局限于几种特定的真菌和细菌中。对于高效的α-淀粉酶的需求越来越多，这可以通过对现有酶的化学改良或者通白质工艺改良得到。得益于现代生物技术的发展，α-淀粉酶在制药方面的重要性日益凸显。当然，食品和淀粉工业仍然是主要市场，α-淀粉酶在这些领域的需求仍然是最大的【11，12】。

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谢辞

本论文是在曹珂珂老师的精心指导下完成的。曹老师勤恳的工作作风、严谨的治学态度、深邃的学术思想、雄阔的科研视野令我受益匪浅、受用终生，置身其间，耳濡目染，潜移默化，使我不仅接受了全新的思想观念，树立了宏伟的学术目标，领会了基本的思考方式，掌握了通用的研究方法，而且还明白了许多待人接物与为人处世的道理，在此学生表示衷心的感谢和敬意。尤为重要的是，曹老师严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力，使我如沐春风、倍感温馨、终生难忘.同时，我也十分感谢食品系每一位帮助过我的师长，他们对我在工作生活中的关心与支持，使我顺利的完成了毕业论文设计，祝福他们今后工作学习顺利。

在此，特向尊敬的老师致以最崇高的敬意和衷心的感谢。衷心感谢曹老师和田老师在试验进行和论文撰写中给与的悉心指导，是你们的无私帮助使我顺利完成毕业论文设计在此向你们表示深深的谢意。

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参考文献

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