实验方法

Western blot 实验

1、试剂配制： （一）母液

1.0mol/L Tris·HCl

Tris (MW121.14) 12.12g 蒸馏水 50ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8（见下所示），最后用蒸馏水定容至100ml，室温下保存。 注：PH ： 6.8 约需22ml浓盐酸

10％ SDS

SDS 10g

蒸馏水定容至 100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周，最好现配先用。

1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris 18.2g

蒸馏水 50ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用蒸馏水定容至100ml，室温下保存。

30％Acr/Bic（29：1） 丙稀酰胺（Acr） 29g 甲叉双丙稀酰胺Bic 1g 蒸馏水至 100ml

37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。

20％Tween20

Tween20 20ml 蒸馏水至 100ml 混匀后4℃保存。

10*TBS NaCl 80g KCl 2g Tris 30g

蒸馏水定容至1000ml，溶解后，4℃保存。

TBST

20％Tween20 5ml

10*TBS 100ml

混匀后即可使用，最好现用现配。

TBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液） 20％Tween20 1.65ml 1*TBS 700ml

混匀后即可使用，最好现用现配。

电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％ SDS） Tris 3.03g

甘氨酸 18.77g SDS 1g

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，每次溶液可重复使用3～5次。

转膜缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇） 甘氨酸 14.4g Tris 3g

甲醇 200ml 蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

10％分离胶和4％浓缩校

10％分离胶（两块胶，10ml） 蒸馏水 4.0ml

30％Acr/Bic 3.3ml 1.5mol/L Tris 2.5ml 10％SDS 100μl 10% AP 100μl TEMED 5μl

4％浓缩胶（两块胶，5ml） 蒸馏水 3.4ml

30％Acr/Bic 830μl 1.0mol/L Tris 630μl 10％SDS 50μl 10% AP 50μl TEMED 5μl

封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）

脱脂奶粉 5g TBST 100ml

溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。 BSA 0.3g TBST 20ml

溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。

贴壁细胞总蛋白的提取：

1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一 会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2、每瓶细胞加1ml 4℃预冷的PBS。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 3、按100ml RIPA加1μlPMSF，摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

4、每孔细胞加200μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解 培养瓶要经常来回摇动。

5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 6、于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷） 7、将离心后的上清分装转移倒EP管中放于－20℃保存。 煮蛋白：

1、取100ul上清，加入25ul的5*SDS-PAGE上样缓冲液混匀。 2、95℃ 5min，45℃，放4℃保存。 SDS－PAGE电泳：

一、清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在烘箱晾干。 二、灌胶与上样 1、玻璃板对齐后放入夹子中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）

2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用1ml枪吸取1ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）

3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4、按前面方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

5、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）

6、加足够的电泳液后开始准备上样。3ul marker ，7.5ul蛋白（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量移液器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，移液器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。 三、电泳

上层胶电泳：80V，20min；待样品跑至下层胶，且每孔样品在同一水平时，电泳调整至：110V，90 min。带条带跑至玻璃板最下方即可终止电泳，进行转膜。 四、转膜 （1）、转一张膜需准备4张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的PVDF膜。切 滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的PVDF膜，在甲醇中浸泡3s，置于双蒸水中浸泡后才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水）。 （2）、在加有转膜液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和 浸过的膜。 （3）、将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以 擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫2层滤纸（可2张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。 （4）、要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。 撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。） （5）、将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电 转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用100V转移2h。 （6）、转完后将膜用1×TBST清洗3遍，15分/次。 五、封闭 封闭液： BSA 0.3g TBST 20ml

将封闭用的盒子用双蒸水清洗干净后置干，倒入配好的封闭液，将贴着胶的那面膜视为正面，将膜放入封闭液时，正面朝上，反面朝下，室温振荡2h，结束后用TBST清洗，15分/次，共3次。

六、孵育抗体：

1、将一抗按说明书比例稀释：1:1000（TBST），倒入敷育盒中，将膜正面朝上放入孵育液中，室温振荡2h后，置于4度冰箱过夜，至少8小时。

2、回收一抗，可重复利用，后用TBST清洗三次，15min/次。 3、将二抗按比例稀释后倒入敷育盒，室温振荡2h。 七、曝光： 配置曝光液

每张膜曝光30张左右。

测序： 一、取血

二、全血基因组DNA提取：

本试剂盒分 Part I 和 Part II 两部分 ■ Part I 部分（-20℃保存） Proteinase K（20 mg/ml） 1 ml RNase A（10 mg/ml） 500 μl

■ Part II 部分（室温 15～25℃保存） 10×Buffer RCL A*1 10×Buffer RCL B*2 Buffer GB*3 Buffer WA*3 Buffer WB*4 Elution Buffer

Spin Columns 50 支 Collection tubes 50 支

*1 和*2 使用前按照 1:4 的比例混合，得到 10×Buffer RCL（红细胞裂解液）。该 10×Buffer RCL可以现用现配或在首次使用时将*1 全部倒在*2 的试剂瓶中，于 4℃可保存 1 年。 *3 含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤时，请立即到医院进行处理。

*4 在首次使用前，请添加 56 ml 的 100%乙醇，混合均匀。 【试剂盒之外所需准备试剂】 ◆ 无水乙醇 ◆ 灭菌蒸馏水 ◆ PBS Buffer ● 保存与运输

1. 本试剂盒分两部分保存和运输，Part I 请在-20℃保存和运输；Part II 在室温下（15-25℃）保存和运输。

2. 10×Buffer RCL A，10×Buffer RCL B 可于室温下保存，按比例混合后的 10×Buffer RCL 可于 4℃保存 1 年，客户可根据实际使用情况决定保存方式。 ● 实验前的准备 1. 准备 56℃水浴。

2. 将 10×Buffer RCL A 和 10×Buffer RCL B 按照 1:4 的比例混合，得到 10×Buffer RCL。在使用前用灭菌蒸馏水将 10×Buffer RCL 稀释 10 倍后使用，按照要处理全血 2 倍体积量准备 1×Buffer RCL，并且要现配现用，请勿将稀释液长时间保存，以免影响裂解效果。 3. Buffer WB 在首次使用前，请添加 56 ml 的 100%乙醇，混合均匀。

4. 洗脱结合于 DNA 制备膜上的基因组 DNA 时，将 Elution Buffer 或灭菌蒸馏水加热至 65℃使用将会提高基因组 DNA 的洗脱效率。 提取无核红细胞血液材料时：

◆ 200 μl～1 ml 新鲜全血起始：按照操作步骤 1～15 进行；

◆ 200 μl～1 ml 冻存全血起始：2,000 rpm 离心 5 分钟，弃多余上清（使用移液器小心吸取），保留 200 μl 上清及沉淀物，处理好的样品直接按操作步骤 7～15 继续操作； ◆ 全血体积不足 200 μl 时，用 PBS 将全血总体积补至 200 μl后直接按操作步骤 7～15 继续操作。

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